沙门氏菌的检测方法和试剂盒与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种沙门氏菌的检测方法和试剂盒。

背景技术：

1、目前高灵敏度分子检测的技术以荧光定量pcr为主，该技术经过二十多年的发展，已经非常成熟，并且被广泛应用于各种场景的分子检测。为了解决荧光定量pcr在核酸快速检测领域的不足，多种在等温条件下进行快速核酸扩增的技术成为近年来研究关注的重点，其中主要技术包括以下几种：转录介导扩增及其衍生技术、环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(rpa技术)或其衍生技术。

2、荧光定量pcr技术需要配置价格昂贵且不方便携带的仪器方能实现检测，并且检测的时间通常超过40分钟，这些缺点在很大程度上限制了该技术在poct(即时检验，point-of-care)领域的应用。转录介导扩增及其衍生技术，由于反应机理的制约，其整体检测时间长，灵敏度也有一定的局限性，无法做到短时间内高灵敏检测；环介导等温扩增具有快速且灵敏的特性，但其抗污染能力弱导致的假阳性限制了其在核酸快检方向的应用；重组酶聚合酶扩增技术(rpa技术)或其衍生技术相关的研究较多，但是目前应用于临床的产品很少，其操作复杂、荧光信号较弱的问题使其难以满足超快速高灵敏检测的需求。因此，改进基于核酸扩增的检测技术，以简化检测手段是目前有待解决的问题。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种沙门氏菌的检测方法，以简化沙门氏菌检测手段，提高检测速度。基于该检查方法，本发明的另一目的在于提供一种用于沙门氏菌检测的试剂盒。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、第一方面，提供了一种沙门氏菌的检测方法，该检测方法包括：

4、(a)rpa扩增：利用rpa扩增沙门氏菌的目标dna，且上游引物或下游引物的5’端连接有rna聚合酶启动子序列；

5、(b)转录：使用rna聚合酶转录扩增产物，得到单链rna，使用探针结合所述单链rna；所述探针标记有发光基团和淬灭基团；

6、(c)光信号检测：使用核酸酶切割与rna结合的探针，通过检测发光基团释放的信号，分析待测样本中的沙门氏菌。

7、第二方面，还提供了一种用于沙门氏菌检测的试剂盒，该试剂盒包含(a)～(c)

8、(a)用于rpa扩增沙门氏菌的目标dna的引物；且上游引物或下游引物的5’端连接有rna聚合酶启动子序列；

9、(b)与rpa扩增产物的转录得到的单链rna结合的探针，所述探针标记有发光基团和淬灭基团；

10、(c)用于rpa扩增的重组酶、聚合酶、单链dna结合蛋白；以及识别所述rna聚合酶启动子序列的rna聚合酶和切割探针的核酸酶。

11、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

12、(1)高灵敏度：应用本发明的方法可以实现对am(10-18mol/l)级别的dna检测，优选方案中检测限低至10个拷贝，除了沙门氏菌快速定性检测外，也可以实现沙门氏菌的早期筛查，避免假阴性，降低漏检率。

13、(2)高特异性：检测时间可短至30min，通过分析光信号数值变化，同时结合多重序列特异性，最大可能降低假阳性，增强特异性。

14、(3)快速：本发明可以短至半小时内完成检测，可实现沙门氏菌的快速检测。

15、(4)便捷：实现单管多个试剂的一步法检测，操作方便，步骤简单；且该检测方法所需的温控要求较低，且由于本发明的光信号强度被放大，因此对光信号采集元器件的要求也比较低。

技术特征：

1.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述目标dna来源于inva基因；

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述rna聚合酶包括t7 rna聚合酶；

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述核酸酶包括双链特异性核酸酶；

5.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，(a)rpa扩增、(b)转录和(c)光信号检测在同一反应体系中进行；

6.一种用于沙门氏菌检测的试剂盒，其特征在于，包含(a)～(c)

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述目标dna来源于inva基因；

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述rna聚合酶包括t7 rna聚合酶；

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸酶包括双链特异性核酸酶；

10.根据权利要求6～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括检测试剂；

技术总结
本发明提供了一种沙门氏菌的检测方法和试剂盒，涉及生物技术领域。该检测方法包括(A)RPA扩增：利用RPA扩增沙门氏菌的目标DNA，且上游引物和/或下游引物的5’端连接有RNA聚合酶启动子序列；(B)转录：使用RNA聚合酶转录扩增产物，得到单链RNA，使用探针结合单链RNA；探针标记有发光基团和淬灭基团；(C)光信号检测：使用核酸酶切割与RNA结合的探针，通过检测发光基团释放的信号，分析待测样本中的沙门氏菌。该检测方法具有快速和便捷的优势，该检测方法发光信号被增强，且可以恒温进行，对检测设备元器件的要求较低。

技术研发人员：庄源,陈敏,丰俊,陈洪友,张曦,袁政安,吴寰宇,罗嘉远,陈涌,高芬
受保护的技术使用者：上海市疾病预防控制中心
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5