一种人GPC3蛋白及其原核表达和纯化方法

本发明属于生物，具体涉及一种人gpc3蛋白制备技术

背景技术：

1、肝癌是肝脏最常见的原发性癌症，包括肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，icc)和混合型肝细胞癌-胆管癌(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，chcc-cca)，其中hcc约占所有原发性肝癌的90％。hcc的早期诊断十分困难，肝癌早期常无明显症状，患者可能只表现出一些非特异性的消化道不适，如食欲不振、恶心和呕吐等，超过85％的肝癌患者在就医时已经是晚期，生存期通常不到2年。因此，进行肝癌早期筛查对延长患者的生存期和提高生活质量有重要意义。

2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，gpc3)在正常肝组织中不表达或低表达，在hcc中特异性高表达；相关研究证实，gpc3通过激活wnt信号通路介导肝细胞恶变并促进hcc生长，与hcc的临床预后高度相关。因此，gpc3作为hcc的特异性标记物，有望成为肿瘤可视化精准诊疗的重要靶标。

3、因此，表达纯化出人gpc3蛋白，可以为后续获得相应的抗gpc3抗体奠定坚实的基础，用于hcc的诊疗。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺点和不足之处，本发明的目的之一在于以基因工程菌株b32g(pet32a-gpc3-bl21)为对象，建立一种gpc3蛋白高表达方法；目的之二是建立一种从包涵体中提取纯化出trxagpc3融合蛋白的方法；目的之三是建立一种分离纯化单一的gpc3蛋白的方法。

2、本发明目的通过以下技术方案实现：

3、一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，该方法按照以下步骤：

4、(1)构建trxa-gpc3融合蛋白的表达载体，即重组质粒pet32a-gpc3；

5、(2)trxa-gpc3融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pet32a-gpc3转入bl21(de3)大肠杆菌，经iptg诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集沉淀；

6、(3)trxa-gpc3融合蛋白的纯化：将沉淀经洗涤后，变性溶解并复性，采用亲和层析法进行纯化；

7、(4)trxa标签的切除与gpc3蛋白的分子筛纯化：测定溶液中的trxa-gpc3蛋白浓度并进行酶切，通过分子筛纯化得到gpc3蛋白；

8、进一步的，步骤(1)所述构建trxa-gpc3原核表达载体并获得重组质粒pet32a-gpc3具体按照以下步骤：从genbank获取人gpc3蛋白的基因序列，根据大肠杆菌密码子偏好、gc含量等进行优化并合成。根据优化后的序列设计扩增gpc3蛋白35-554位置的氨基酸对应基因的上下游引物，将优化后基因序列克隆pet32a载体中，构建重组质粒pet32a-gpc3。将重组质粒转化e.coli dh5α感受态细胞，并在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb板中培养。挑取形态大小较好的单克隆先进行菌液pcr鉴定，然后提取质粒进行酶切鉴定，最后将阳性的单克隆菌液送去测序鉴定，保存鉴定结果正确的重组质粒pet32a-gpc3。

9、步骤(2)所述trxa-gpc3融合蛋白的原核表达具体按照以下步骤：将鉴定正确的pet32a-gpc3质粒转化入e.coli bl21(de3)表达感受态细胞，在37℃培养箱中倒置过夜培养后挑取单菌落至2ml含50μg/ml羧苄青霉素的lb培养基中，37℃下以220rpm振荡培养12～16h。按照1∶100的比例将菌液接种于20ml含50μg/ml羧苄青霉素以及1％(w/v)葡萄糖浓度的lb培养基中，37℃下振荡培养3～4h至od600为0.6左右，加入0.25mm iptg，再于20℃以120rpm的速度振荡培养20h。低温离心收集菌体，在冰浴中进行超声波破碎，以4℃、10000rpm离心20min，分离上清与沉淀，然后进行sds-page电泳分析。

10、步骤(3)所述trxa-gpc3融合蛋白的纯化具体按照以下步骤：每克湿菌加入20mltbs(ph 8.0)重悬，使用超声波破碎仪进行破碎，收集包涵体，使用包涵体洗涤液a(0.5％triton x-100v/v、20mm tris-hcl、150mm nacl)反复洗涤，最后用包涵体洗涤液b(8m尿素、20mm tris-hcl、150mm nacl)洗涤一次，溶解于变性液(8m尿素、20mm tris-hcl、150mmnacl、5mm dtt)中，高速离心，收集上清。将变性后的蛋白用变性液稀释至0.5mg/ml后装入透析袋中。将透析袋用密封夹夹好后按4、2、1、0m的梯度依次降低透析液中的尿素浓度，透析液中添加1mm gsh和0.2mm gssg，4℃低速搅拌透析，4～6h更换新鲜透析液一次，最后用tbs(ph 8.0)4℃透析过夜，高速离心去除沉淀，上清过滤膜后加入到含有ni-nta琼脂糖凝胶的层析柱中，用tbs(ph 8.0)平衡3～5cv后进行反复上样，用10～15 cv含有50mm咪唑的tbs(ph 8.0)进行洗杂，最后用3cv含有500mm咪唑的tbs(ph 8.0)进行洗脱去除杂蛋白获得较高纯度的融合蛋白trxa-gpc3。

11、步骤(4)所述trxa标签的切除与gpc3蛋白的分子筛纯化具体按照以下步骤：初步纯化后的trxa-gpc3融合蛋白使用bca法检测蛋白浓度并计算溶液中的蛋白含量，在酶切反应体系(25mm tris，150mm nacl，0.1％tween-20v/v，ph 8.0)中按0.1mg∶0.1u的比例加入凝血酶进行酶切，酶切完成后加入10mm edta终止反应。将酶切后的蛋白溶液加入到将含有分子筛填料sepharose 4fast flow的层析柱中，并将柱子连接akta系统，用1.5cv的tbs(ph8.0)以0.5ml/min的速度进行洗脱，所得洗脱液即是含有高纯度的目的蛋白gpc3。

12、优选的，所述步骤(1)中的上游引物如seq id no.1所示；

13、优选的，所述步骤(1)中的下游引物如seq id no.2所示

14、优选的，所述步骤(1)中优化后的gpc3蛋白序列如seq id no.3所示

15、优选的，所述步骤(1)中重组质粒pet32a-gpc3编码trxa-gpc3蛋白，大小约为78kda，编码所述trxa-gpc3蛋白基因序列信息如seq id no.4所示

16、与现有的方法相比，本发明具有以下优点及有益效果：

17、本发明所构建的gpc3原核表达载体，优化的表达条件，可以提高目的蛋白的表达，采用本发明所用纯化方法，可以获得高纯度的trxagpc3融合蛋白，采用本发明所用酶切与分子筛纯化方法，可以得到单一的具有活性的gpc3蛋白。

技术特征：

1.一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，该方法按照以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤1)所述构建trxa-gpc3原核表达载体并获得重组质粒pet32a-gpc3具体按照以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述的上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示；下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求2所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤3)所述的lb板上的培养基为50μg/ml羧苄青霉素。

5.根据权利要求1所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤2)所述trxa-gpc3融合蛋白的原核表达具体按照以下步骤：

6.根据权利要求1所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤3)所述trxa-gpc3融合蛋白的纯化具体按照以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，所述的包涵体洗涤液a包含下述组分：0.5％(v/v)triton x-100、20mm tris-hcl、150mm nacl；所述的包涵体洗涤液b包含下述组分：8m尿素、20mm tris-hcl、150mm nacl；所述的变性液包含下述组分：8m尿素、20mm tris-hcl、150mm nacl、5mm dtt；所述的tbs的ph 8.0。

8.根据权利要求1所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，步骤4)所述trxa标签的切除与gpc3蛋白的分子筛纯化具体按照以下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种人gpc3蛋白的原核表达和纯化方法，其特征在于，所述的酶切反应体系为25mm tris，150mm nacl，0.1％(v/v)tween-20，ph 8.0。

10.一种人gpc3蛋白，其特征在，由权利要求1-9任一所述的方法制备得到的。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人GPC3蛋白及其原核表达和纯化方法；本发明提供的方法，主要包括构建pET32a‑GPC3蛋白表达质粒、将pET32a‑GPC3蛋白表达质粒转化、培养表达TrxA‑GPC3蛋白、纯化TrxA‑GPC3蛋白、切除TrxA标签蛋白并通过分子筛得到GPC3蛋白等过程。本发明将能在大肠杆菌中高表达的TrxA标签蛋白与编码人GPC3蛋白的基因进行重组，来提高目的蛋白的表达量和稳定性，然后利用酶切和分子筛纯化出单一的GPC3蛋白的。采用本发明提供的方法，操作方便，成本低，纯化效果好，为免疫学快速诊断、制备单抗等提供物质基础。

技术研发人员：赵肃清,梁锦慧,龚鑫
受保护的技术使用者：广东工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/6/13