一种海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株及其发酵培养方法

本发明属于微生物及微生物发酵工程，具体涉及一种从海洋中筛选的可低温产β-半乳糖苷酶的菌株及发酵生产β-半乳糖苷酶工艺的方法。

背景技术：

1、半乳糖苷酶是指一类水解含半乳糖苷键物质的酶类。主要分为α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶。

2、β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因(lacz基因)编码，是由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。从不同物种提取的β-半乳糖苷酶的蛋白质序列有着较高的同源性和相似性。

3、β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶，存在多种微生物来源，除了水解活性，某些来源的β-半乳糖苷酶也具有转糖基活性。来源不同的酶具有不同的特性，例如酶的最适ph，最适温度，动力学常数km会有所区别。

4、β-半乳糖苷酶除了能够催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖基的作用。早期的研究表明，β-半乳糖苷酶上的活性位点有两个功能团：cys的巯基和his的咪唑基，它们对β-半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用。据推测，硫基可作为广义酸使半乳糖苷的氧原子质子化，而咪唑基可作为亲核试剂进攻半乳糖分子第1个碳原子上的亲核中心，形成1个含碳氢键的共价中间物。在被切割下咪唑基之后，巯基阴离子从水分子中抽取1个质子，从而形成-oh进攻c。

5、影响产酶量和活力的因素：影响β-半乳糖苷酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。

6、目前，国内大型低乳糖乳制品加工生产中使用的产β-半乳糖苷酶菌株易退化，发酵条件苛刻，由于乳制品加工与运输过程一般为低温环境，故价格昂贵，且不能回收和重复利用，生产成本较高，技术难度大，导致我国低乳糖奶的生产规模都比较小且分散，阻碍了低乳糖奶的推广。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株及其发酵培养方法，提供一种从海洋中筛选可低温产β-半乳糖苷酶的菌株，并将此菌株基因提取克隆于大肠杆菌中表达生产β-半乳糖苷酶的生产方法。经过筛选及培养基优化的发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株，菌株为芽孢杆菌k-3，拉丁文名为bacillus sp.k-3；于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号cctcc no.m2024513，保藏时间为：2024年3月18日。

3、本发明的另一目的是保护上述芽孢杆菌k-3的应用，具体应用于在低温环境中获得β-半乳糖苷酶。

4、本发明的又一目的是保护上述芽孢杆菌k-3生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，步骤如下：

5、1.将该菌种接种于富集培养基中，温度为15℃培养32h；

6、2.将从海泥中分离纯化所得菌株富集培养后，再接种到β-半乳糖苷酶菌株筛选培养基平板上，置于15℃恒温箱培养，初筛6-15d，复筛4d；

7、3.尿素法提取产酶菌株的基因组dna.以提取的dna为模板复制至大肠杆菌中进行测序及系统发育分析；

8、4.待单菌落直径大小约1mm时，进行革兰氏染色，观察到紫色均匀单菌株呈细短杆状即完成。

9、进一步的，所述步骤1中使用的富集培养基成分如下：大豆肉汤水解物1.25g/l，酪蛋白水解物4.25g/l，氯化钠0.63g/l，乳糖1.5g/l，磷酸氢二钠0.63g/l，ph 6.0。

10、进一步的，所述步骤2中培养温度为15℃，培养时间为30～33小时，培养点ph值在6～7的生产范围。

11、本发明的进一步优选，所述步骤2中培养温度为15℃，培养点ph值为6。

12、进一步的，所述步骤3中尿素法具体为将菌种直接接种于种子培养基中，然后以5％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

13、进一步的，所述步骤3中使用的种子培养基成分如下：乳糖5.0g/l，胰蛋白胨5.0g/l，kcl 0.05g/l，kh2po40.1g/l，nacl2.0g/l，mgso4·7h2o 0.05g/l，feso4·7h2o 0.03g/l，cacl20.11g/l，mnso4·h2o 0.005g/l。

14、进一步的，所述步骤3中使用的发酵培养基成分如下：选取乳糖作为碳源，用量为7g/l；选取胰蛋白胨作为氮源，用量为9g/l。无机盐kh2po4、feso4·7h2o、mgso4、cacl2的添加量分别为：0.04g/l，0.06g/l，0.006g/l，0.04g/l。

15、本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明产β-半乳糖苷酶的菌株可广泛用于医药、环保、基因治疗等多个领域，具有广阔的市场前景，并具有重要意义。

技术特征：

1.一种海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于，菌株为芽孢杆菌k-3，拉丁文名为bacillus sp.k-3；于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号cctcc no：m 2024513，保藏时间为：2024年3月25日。

2.如权利要求1所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株的应用，其特征在于，具体应用于在低温环境中获得β-半乳糖苷酶。

3.如权利要求1所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，步骤如下：

4.根据权利要求3所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s1使用的富集培养基成分如下：大豆肉汤水解物1.25g/l，酪蛋白水解物4.25g/l，氯化钠0.63g/l，乳糖1.5g/l，磷酸氢二钠0.63g/l，ph 6.0。

5.根据权利要求3所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s2中培养温度为15℃，培养时间为30～33小时，培养点ph值在6～7的生产范围。

6.根据权利要求5所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s2中培养温度为15℃，培养点ph值为6。

7.根据权利要求3所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s3中尿素法具体为将菌种直接接种于种子培养基中，然后以5％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

8.根据权利要求3所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s3中使用的种子培养基成分如下：乳糖5.0g/l，胰蛋白胨5.0g/l，kcl 0.05g/l，kh2po40.1g/l，nacl2.0g/l，mgso4·7h2o0.05g/l，feso4·7h2o0.03g/l，cacl20.11g/l，mnso4·h2o 0.005g/l。

9.根据权利要求3所述的海洋来源产β-半乳糖苷酶的菌株生产β-半乳糖苷酶的发酵培养方式，其特征在于，所述步骤s3中使用的发酵培养基成分如下：选取乳糖作为碳源，用量为7g/l；选取胰蛋白胨作为氮源，用量为9g/l。无机盐kh2po4、feso4·7h2o、mgso4、cacl2的添加量分别为：0.04g/l，0.06g/l，0.006g/l，0.04g/l。

技术总结
本发明属于微生物及微生物发酵工程技术领域，公开了一种海洋来源产β‑半乳糖苷酶的菌株及其发酵培养方法。菌株为芽孢杆菌K‑3，拉丁文名为Bacillussp.K‑3；于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC No.M2024513，保藏时间为：2024年3月25日。本发明产β‑半乳糖苷酶的菌株可广泛用于医药、环保、基因治疗等多个领域，具有广阔的市场前景，并具有重要意义。

技术研发人员：王晓辉,赵子琪,唐洪滢,张子名
受保护的技术使用者：大连大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/29