改造的免疫细胞、靶向BRD9基因的gRNA和应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种改造的免疫细胞、靶向brd9基因的grna和应用。

背景技术：

1、免疫细胞在癌症、传染病和自身免疫的免疫控制中发挥着重要作用。以细胞毒性t细胞为例，cd8+t细胞是细胞毒性免疫细胞，通过直接杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤免疫作用。抗原特异性cd8+t细胞的激活由t细胞受体(tcr)识别主要组织相容性复合体(mhc)i类(mhc-i)提呈的同源抗原，导致t细胞增殖、细胞因子产生和靶细胞杀伤。t细胞缺陷可导致反复感染或癌症，而cd8+t细胞的过度激活可导致免疫病理学和自身免疫。cd8+t细胞已成为新的癌症治疗药物的聚焦点。经批准的免疫检查点抑制剂通过中和ctla-4或pd-1/pd-l1增强cd8+t细胞的抗肿瘤反应。无论是单药还是与其他疗法联合使用，这些药物在多种肿瘤适应症中都有效。

2、利用免疫细胞与嵌合抗原的细胞治疗受体(cars)已证明在治疗肿瘤方面取得了临床成功。但是很大一部分患者对目前批准的疗法仍然没有反应或有不希望有的副作用。发现以前未知的调节免疫细胞功能的基因，可为免疫疗法开辟不同的途径。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种改造的免疫细胞，以期进一步提高免疫细胞对肿瘤的杀伤能力。本发明的第二目的在于提供上述改造的免疫细胞的制备方法和用于制备方法中涉及的相关产品，以提高上述改造的免疫细胞的制备效率。本发明的目的还在于提供包括上述改造的免疫细胞及其制备方法在肿瘤药物方面的应用。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、第一方面，提供了一种改造的免疫细胞，所述免疫细胞的brd9基因表达被下调或清除。

4、可选的实施方式中，所述免疫细胞选自t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。

5、可选的实施方式中，所述brd9基因表达被下调或清除是通过至少一种crispr/cas基因编辑系统进行了基因编辑。

6、可选的实施方式中，所述crispr/cas基因编辑系统包含至少一种靶向brd9基因的grna，所述grna的靶点序列包括seq id no.1所示序列、seq id no.16所示序列、seq idno.1的反向互补序列和seq id no.16的反向互补序列中的至少一种。

7、第二方面，还提供了一种靶向brd9基因的grna，所述grna的靶点序列为seq idno.1或seq id no.16所示序列，或为seq id no.1或seq id no.16的反向互补序列。

8、第三方面，还提供了一种用于编辑brd9基因的组合物，所述组合物包含(ⅰ)和(ⅱ)：

9、(ⅰ)第一sgrna、编码第一sgrna的多核苷酸、第二sgrna和编码第二sgrna的多核苷酸中的至少一种；

10、第一sgrna的靶点序列为seq id no.1所示序列，或为seq id no.1的反向互补序列；

11、第二sgrna的靶点序列为seq id no.16所示序列，或为seq id no.16的反向互补序列；

12、(ⅱ)cas核酸酶或编码cas核酸酶的多核苷酸。

13、第四方面，还提供第一方面的改造的免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括获得第三方面的组合物，将所述组合物引入免疫细胞，从而使brd9基因表达被下调或清除。

14、第五方面，还提供了一种递送系统，所述递送系统包括活性成分和递送载体，所述活性成分包括第二方面的grna，或第三方面的组合物；所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。

15、第六方面，还提供了第一方面的免疫细胞，或第二方面的grna，或第三方面的组合物的组合物，或第四方面的制备方法，或第五方面的递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

16、第七方面，还提供了一种用于治疗肿瘤的药物，所述药物包括第一方面的免疫细胞。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

18、本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除brd9基因的表达提高了增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，共培养条件下，清除率达到了约50％；同时还能增强免疫细胞细胞因子ifn-γ和tnf-α的分泌能力以及脱颗粒能力，进一步增强了免疫细胞的杀伤效果。下调或清除免疫细胞中brd9基因提高了免疫细胞在肿瘤组织中的浸润的数量，增强了肿瘤浸润的t细胞杀伤能力。且体内实验表明，下调或清除免疫细胞中brd9基因能更有效的抑制受试动物的肿瘤增长。

19、本发明利用crispr/cas技术对免疫细胞的brd9基因进行修饰，选择性地敲除brd9基因，进而获得了能够有效抑制肿瘤的免疫细胞。

20、本发明提供的靶向brd9基因的grna靶向特异性好，可以实现对brd9基因进行有效编辑，能有效敲低brd9基因的表达，所构建的免疫细胞所带有的突变基因型稳定性高，具有可遗传性。

21、本发明提供的改造的免疫细胞制备方法简单有效，成本低，所制备的免疫细胞具有持续、高效肿瘤抑制效果，安全性好的优势。

技术特征：

1.一种改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的brd9基因表达被下调或清除。

2.根据权利要求1所述的改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。

3.根据权利要求1或2所述的改造的免疫细胞，其特征在于，所述brd9基因表达被下调或清除是通过至少一种crispr/cas基因编辑系统进行了基因编辑。

4.根据权利要求3所述的改造的免疫细胞，其特征在于，所述crispr/cas基因编辑系统包含至少一种靶向brd9基因的grna，所述grna的靶点序列包括seq id no.1所示序列、seqid no.16所示序列、seq id no.1的反向互补序列和seq id no.16的反向互补序列中的至少一种。

5.一种靶向brd9基因的grna，其特征在于，所述grna的靶点序列为seq id no.1或seqid no.16所示序列，或为seq id no.1或seq id no.16的反向互补序列。

6.用于编辑brd9基因的组合物，其特征在于，包含(ⅰ)和(ⅱ)：

7.权利要求1～4任一项所述的改造的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括获得权利要求6所述的组合物，将所述组合物引入免疫细胞，从而使brd9基因表达被下调或清除。

8.一种递送系统，其特征在于，所述递送系统包括活性成分和递送载体，所述活性成分包括权利要求5所述的grna，或权利要求6所述的组合物；所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。

9.权利要求1～4任一项所述的改造的免疫细胞，或权利要求5所述的grna，或权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的制备方法，或权利要求8所述的递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

10.用于治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的免疫细胞。

技术总结
本发明提供了一种改造的免疫细胞、靶向BRD9基因的gRNA和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除BRD9基因的表达，增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明提供的靶向BRD9基因的gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.16所示，或为其反向互补序列，具有编辑效率高的优势，为免疫疗法开辟了新的途径。

技术研发人员：吴宇轩,田晓玲,刘国龙
受保护的技术使用者：尧唐（上海）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/25