本发明属于生物，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在高产纳豆激酶中的应用。
背景技术：
：：1、纳豆是在浸泡、蒸煮过的黄豆上接种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)发酵而成的一种传统发酵食品，在日本有着悠久的生产和食用历史。日本科学家sumi h.及其团队首次在纳豆中发现了纳豆激酶(nattokinase)具有很强的溶栓活性[1]。同传统的溶栓药物相比，纳豆激酶的溶栓效果更好、耐受剂量更大，引起出血等副作用的概率更小[2]。除此之外，纳豆激酶还有降压、抗癌、治疗玻璃体视网膜病和阿尔兹海默病等功效[3]。由此可见，纳豆激酶是一种高附加值的微生物代谢产物。2、纳豆激酶主要通过微生物发酵得到，然而在已有的报道中，纳豆激酶的发酵产量普遍不是很高[4]，亟待选育高产菌株和找到更好的发酵控制方法以降低生产成本。3、参考文献：4、[1]sumi h.,hamada h.,tsushima h.,et al.anovel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the5、vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in thejapanese diet.experientia,6、1987,43:1110–1111.7、[2]guo h.,ban y.h.,cha y.,et al.comparative anti-thrombotic activityand haemorrhagic8、adverse effect of nattokinase and tissue-type plasminogenactivator.food science and9、biotechnology,2019,28:1535–1542.10、[3]li y.,chen l.,tang x.,li j.biotechnology,bioengineering andapplications of bacillus11、nattokinase.biomolecules,2022,12:980.12、[4]xiao z.,shen j.,li y.,et al.high and economical nattokinaseproduction with acetoin as a13、useful byproduct from soybean milk and glucose.probiotics andantimicrobial proteins,2021,14:792–803.技术实现思路1、针对纳豆激酶产量低的现状，本发明提供一株来源于纳豆、并经突变选育的枯草芽孢杆菌，采用价廉易得的可食用原料，通过增加氧气供给和采用补料分批发酵的方法大幅度提高了纳豆激酶的产量，大大降低了生产成本，极具实际工业生产应用潜力。2、本发明提供的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)jz08-02，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为cctcc no:m2024131，保藏日期为2024年1月17日。3、本发明提供一株枯草芽孢杆菌，并利用这株枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶。本发明提供的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)jz08-02革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状。通过对本发明菌株的16s rdna进行测序，并将本发明菌株的16s rdna序列与genbank数据库中已收录的细菌菌株的16s rdna序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16srdna序列与多株已知枯草芽孢杆菌菌株的16s rdna序列的同源性为100％，与枯草芽孢杆菌模式株bacillus subtilis ncib 3610t相似度99.93％。4、采用本发明提供的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)jz08-02，发酵生产纳豆激酶的方法，其涉及的实施步骤如下：5、第一步，活化菌株：将本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)jz08-02划线接种到luria-bertani固体培养基上，置于37℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。所述luria-bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，20g琼脂粉。6、第二步，制备液体种子：用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到luria-bertani液体培养基中，37℃摇床培养13h。采用体积为500ml的挡板摇瓶，装液量为150ml；采用回旋式摇床，转速设定在150rpm。所述luria-bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。7、第三步，发酵生产纳豆激酶：将上述步骤获得的液体种子按3.5％体积比接种到灭菌后的发酵培养基中，采用体积为5l的发酵罐，装液量为4l；通入氧气量逐渐由0.8vvm提高至1.5vvm，转速设定在650rpm；发酵温度设定在37℃，在12h补加200g豆浆粉和120g葡萄糖，在16h补加150g葡萄糖。发酵过程中不定时多次取样检测活细胞数(用cfu，即colonyforming unit表示)、葡萄糖的利用情况以及纳豆激酶的产生情况。采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性。8、制备4l所述发酵培养基的方法为：取720g黄豆用自来水洗净、浸泡10小时，沥干，添加约3l自来水磨制豆浆，过120目网兜筛除豆渣。配制70g/l葡萄糖溶液约600ml，分别将豆浆与葡萄糖在121℃下灭菌20min后，混合定容至4l。试验或生产时可根据生产规模的需要，参考此比例放大或缩小体积进行发酵培养基的制备。9、本发明采用可食用原料，使纳豆激酶的产量达到非常高的水平，大大降低了生产成本，极具实际工业生产应用潜力。技术特征：1.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)jz08-02，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctcc no:m 2024131。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌jz08-02在发酵生产纳豆激酶中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌jz08-02发酵生产纳豆激酶，所采用的原料为黄豆、葡萄糖、豆浆粉，通过增加氧气供给和采用补料分批发酵的方法提高纳豆激酶产量。技术总结本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在高产纳豆激酶中的应用方法。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZ08‑02，已于2024年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2024131。该菌株革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状。利用本发明菌株，以黄豆、葡萄糖、豆浆粉为原料，采用机械搅拌发酵罐进行发酵，通过通入氧气增加氧气供给，采用补料分批发酵的方法，经37℃发酵36h可得到酶活力为18014±112IU/mL的纳豆激酶。本发明采用可食用原料，使纳豆激酶的产量达到非常高的水平，大大降低了生产成本，极具实际工业生产应用潜力。技术研发人员：肖梓军,郑家文,赵静宜受保护的技术使用者：中国石油大学（华东）技术研发日：技术公布日：2024/7/11