一种RAA-LFD检测犬流感病毒的引物和探针组合及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种raa-lfd检测犬流感病毒的引物与探针组合及应用。

背景技术：

1、犬流感病毒(canine influenzavirus，civ)h3n2是引起犬严重急性呼吸道疾病的重要病原体目前能够感染犬的流感病毒主要有h3n2亚型civ和h3n8亚型civ，并且能够在犬群内持续传播。h3n8亚型civ主要在美国犬群中流行，并形成稳定的谱系；我国犬群主要感染h3n2亚型civ。因此，快速、准确、方便的检测方法对于早期临床诊断和控制civ感染至关重要。目前已开发出许多civ检测方法，如qpcr和elisa等，但反应时间较长，且需要使用昂贵的设备和专业的实验人员。因此，建立快速准确的临床诊断方法作为预防和控制civ感染的第一道防线非常重要。

2、目前核酸等温扩增(isothermal amplification)技术研究较多，与传统pcr核酸扩增技术相比较，等温扩增技术具有敏感性高、特异性强、简单方便、反应快速、不需要复杂精密仪器等优点。其中，重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinaseaidedamplification，raa)是一种新颖的等温核酸扩增技术。其原理与重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymerase amplification，rpa)相似，是一种利用重组酶、单链dna结合蛋白和引物形成聚合体扫描双链dna，在与引物同源的序列处使双链dna解旋，单链结合蛋白(singlestrandeddnabinding，ssb)防止单链dna复性，在能量和dntp存在的情况下开始复制延伸，形成新的dna互补链，整个反应在37-42℃恒定温度，20-30min内即可完成。raa扩增结果可通过凝胶电泳、荧光素修饰或侧向流免疫层析法进行分析，其中，侧向流试纸条法(lateralflow dipstick，lfd)利用胶体金纳米颗粒和生物素-亲和素系统等进行信号检测，不需要特定仪器，具有特异性强、简单、快速、直观等优点。目前，raa-lfd已被用于非洲猪瘟病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、牛冠状病毒或口蹄疫病毒等多种病原体的诊断。raa-lfd技术填补了传统方法和技术依赖热敏设备的空白，有望在未来成为pcr核酸扩增的替代技术。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种raa-lfd检测犬流感病毒的引物与探针组合，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。

2、进一步，所述探针序列的修饰如下：探针的5’端标记一个fam荧光基团，3’端标记一个c3 spacer荧光基团，探针的第32位为脱碱基位点。

3、本发明还提供了一种犬流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物和探针组合。

4、本发明还提供了一种raa-lfd检测犬流感病毒的方法，包括如下步骤：

5、以待测样品的基因组dna为模板，利用本发明的引物和探针组合进行raa扩增，采用侧流层析试纸对raa扩增产物进行检测。

6、进一步，所述raa扩增体系为50μl，其中，再水化缓冲液29.4μl，正向引物2μl，反向引物2μl，探针0.6μl，质粒模板1μl，醋酸镁溶液2.5μl，余量为无菌水。进一步，所述raa扩增程序为水浴33～40℃反应10～40min。

7、优选地，所述raa扩增程序为水浴37℃反应20min。

8、本发明还提供了所述引物与探针组合在在制备检测犬流感病毒的试剂或试剂盒的应用。

9、本发明相对于现有技术的有益效果在于：

10、本发明根据转化载体pmd19-t与civh3n2 ha基因(genbank:jx101437.1)的连接区域序列设计并筛选出一套利用raa可快速有效检测出civh3n2成分的引物和探针组合，开发了一种具有高特异性和高灵敏度的raa-lfd快速检测法。以civha质粒为模板，利用本方法中的引物和探针进行raa-lfd试纸条检测，可以获得明显的检测条带。将阳性基因质粒标准品稀释至106-101copies/μl，均有阳性指示带。本发明的raa检测引物与探针组合特异性强，试剂盒以侧流层析试纸卡为终点检测，无需昂贵仪器，经济适用，具有操作简便、适应环境广、速度快、特异性高、灵敏度好等特点。

技术特征：

1.一种raa-lfd检测犬流感病毒的引物与探针组合，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。

2.根据权利要求1所述的引物与探针组合，其特征在于，所述探针序列的修饰如下：探针的5’端标记一个fam荧光基团，3’端标记一个c3 spacer荧光基团，探针的第32位为脱碱基位点。

3.一种检测犬流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。

4.一种raa-lfd检测犬流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述raa扩增体系为50μl，其中，再水化缓冲液29.4μl，正向引物2μl，反向引物2μl，探针0.6μl，模板1μl，醋酸镁溶液2.5μl，余量为无菌水。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述raa扩增程序为水浴33～40℃反应10～40min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述raa扩增程序为水浴37℃反应20min。

8.权利要求1或2所述的引物与探针组合在制备检测犬流感病毒的试剂或试剂盒的应用。

技术总结
本发明提供了一种RAA‑LFD检测犬流感病毒的引物与探针组合及其应用。本发明涉及分子生物学技术领域。该方法基于RAA技术和LFD技术，具有高特异性和敏感性。通过对CIV HA质粒引物、探针设计及筛选、RAA‑LFD反应温度、反应时间优化、RAA‑LFD灵敏度、特异性及最低检测限检验，成功开发了CIV快速检测方法。该方法可在37℃等温条件下20min内完成检验，与传统PCR方法相比，该方法更快速、更灵敏，还可特异性检测出不同病原体中的CIV H3N2。本发明对检测人员的实验操作要求不高，也不依赖于任何复杂的实验仪器，更适用于现场检测，对CIV H3N2的诊断具有重要意义。

技术研发人员：高艳春,王海燕,李彦伟,宋相阳,兰康,鲍雅萱,聂思静
受保护的技术使用者：北京科牧丰生物制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/23