一种基于数字微流控技术的全自动细胞DNA与蛋白质相互作用分析方法

本发明涉及dna与蛋白质相互作用分析方法领域，尤其涉及一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法。

背景技术：

1、dna与蛋白质相互作用是表观遗传学的重要调控途径之一，其在真核生物中普遍存在。具体来说，组蛋白、转录因子和其他调节蛋白可与dna结合形成染色质的主要部分，并且在dna复制、dna修复以及基因表达等许多细胞进程中发挥着重要作用。很多研究表明，dna与蛋白质互作的异常会引发细胞功能障碍，从而导致癌症等疾病发生。因此，识别并阐明dna与蛋白质相互作用如何影响细胞功能有助于揭示生物进程中表观遗传调控的机制。其中，通过对dna与蛋白质相互作用的全基因组分析可以提供复杂生物系统的表观遗传景观信息，从而揭示生物进程中表观遗传调控的机制。

2、目前，已开发了许多dna与蛋白质相互作用的分析方法。chip-seq、cut&run和cut&tag等具有代表性的方法通过甲醛交联和超声打断，以及酶系等策略获得组蛋白等染色质结合蛋白周围的dna片段并进行测序，从而得到了dna与蛋白质相互作用的位置和模式信息。在chip-seq程序中，目标蛋白和染色质被甲醛交联、超声打断并与特异性抗体一起孵育，以富集免疫结合的复合体，然后解交联并提取dna，最后进行测序文库制备。然而，dna和蛋白质交联往往导致假阳性率高，并且还存在细胞样本量大，以及抗体特异性差导致的高背景噪音等局限。cut&run利用将细胞固定在凝集素包被的磁珠上，并使用蛋白a-微球菌核酸酶(pa-mnase)来拴系已识别并特异性结合靶蛋白的抗体，然后将目标蛋白质-dna复合物释放到上清液中用于建库和测序。cut&run的信噪比chip-seq有所提高，所需的细胞数量也大大减少，并且没有表位掩蔽和伪影的影响。尽管如此，cut&run仍需要繁琐的dna末端修复和接头连接步骤来制备测序文库。cut&tag技术将tn5转座酶取代mnase与蛋白a融合(pa-tn5)并预装载有测序接头，以一步直接结合和标记与抗体结合的dna，经过pcr扩增后即可生成测序文库。cut&tag简化了整个制样过程，tn5转座酶高效率的集成也有利于生成高质量的测序文库，从而实现了高灵敏度检测，并且进一步将细胞输入量降低到60个。但是这种基于离心管的方法仍面临着挑战，如需要消耗大量的试剂，在多步磁分离中产生核酸损失等，并且对于仅含有数十个细胞的样品(例如植入前的哺乳动物胚胎)的分析仍然具有很大的困难。

3、总之，以上方法还存在分析成本高、步骤繁琐、灵敏度低等问题。因此，亟需开发一种具有低细胞起始量、高检测灵敏度和低试剂消耗的自动化dna与蛋白质相互作用分析方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中细胞dna与蛋白质相互作用的分析中操作步骤繁琐、检测灵敏度和准确度较低、起始细胞输入量较高等上述问题，提供一种基于数字微流控技术(dmf)的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，是一种全自动、高效、准确、灵敏、低成本的分析方法，实现对全基因组范围内的细胞dna与蛋白质相互作用分析。

2、本发明通过程序化操纵液滴的分配、移动和混合，可在单个dmf芯片上集成并自动化整个工作流程；通过构建超疏水界面，减少多步磁分离过程中的核酸吸附，有效提高细胞利用率和降低分析的起始细胞数量，从而提高检测灵敏度；通过构建封闭的亚微升反应空间，可以提高参与反应的dna片段的有效浓度，隔绝外源性污染物，并将试剂消耗量降低12倍。

3、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，包括步骤：

5、1)dmf芯片的制备：所述dmf芯片包括上极板和下极板；所述上极板以氧化铟锡导电玻璃为基底，表面涂覆有特氟龙疏水层；所述下极板以石英玻璃为基底，其上依次覆以电极层、介电层和疏水层；

6、2)细胞捕获：通过糖蛋白和刀豆蛋白a的相互作用，操纵用刀豆蛋白a包被的磁珠液滴在dmf芯片疏水界面对含有细胞的液滴进行捕获；

7、3)抗体孵育：细胞经过洋地黄皂苷透化，随后使含有目标蛋白的特异性抗体(第一抗体)的液滴以及第二抗体的液滴依次与细胞-磁珠复合物共孵育，从而标记和放大目标染色质区域信号，同时通过磁分离和dmf软件控制来移除每个步骤中的上清液和未结合的抗体；

8、4)pa-tn5标记：操纵dmf软件，引入预先负载有测序接头的pa-tn5融合蛋白的液滴，识别与一抗连接的二抗，并通过添加含mg2+的液滴后，pa-tn5被激活并切割目的蛋白附近的dna序列，同时使接头序列在切割的片段两端整合；

9、5)片段富集和文库构建：操纵dmf软件引入含有相应试剂的液滴，在dmf芯片上裂解细胞并使dna片段富集到磁珠上，随后加入扩增引物进行聚合酶链式反应，从dmf芯片上收集得到dna样品并进行纯化、测序。

10、所述dmf芯片下极板包括接触电极、电极引线、储液槽电极和驱动电极，接触电极分别和储液槽电极以及驱动电极间通过电极引线连接，上极板则覆盖在下极板的电极图案上。

11、通过dmf芯片分析时，在下极板左右两边缘贴上聚酰亚胺胶带，然后在电极区域覆上上极板，在上下极板构成的空间内填入二甲基硅油，从而构建一个封闭且低吸附的反应空间。

12、通过dmf软件对液滴的精确操控，使得整个分析过程均在芯片上、下极板构成的空间内以自动化的方式进行。

13、目前，尚未有关基于数字微流控的dna与蛋白质相互作用分析方法的报道，数字微流控技术(digital microfluidics，dmf)可以通过电润湿现象操控单分散液滴的生成、移动、分裂和合并等运动。它结构简单、封闭性高，集成化、自动化、平行化，可以将复杂的实验室功能集成到单个芯片上，并且具有分析试剂和样品消耗少等优点，成为分析细胞内dna与蛋白质相互作用的理想平台。

14、相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

15、(1)从细胞处理到pcr扩增的整个操作流程可集成到单个dmf芯片上，大大简化了步骤，并通过程序控制，实现液滴运动和磁分离步骤自动化；

16、(2)通过构建封闭的亚微升反应空间，有效地富集目标dna和隔绝外源污染物，并且将试剂成本降低了约12倍；

17、(3)通过构建超疏水反应界面，最大限度地减少了细胞吸附，保证了较高的细胞利用率，使得该方法能够以高信噪比分析低至3个细胞的样本，为稀缺临床样本分析的提供有力工具；

18、(4)与目前其他方法相比，本发明具有更高的灵敏度，同时保持高准确度和出色的重复性，在相同测序深度下，本发明能获得最多的测序信号峰，极大地降低了测序成本。

技术特征：

1.一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，其特征在于：所述dmf芯片下极板包括接触电极、电极引线、储液槽电极和驱动电极，接触电极分别和储液槽电极以及驱动电极间通过电极引线连接，上极板则覆盖在下极板的电极图案上。

3.如权利要求1所述的一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，其特征在于：通过dmf芯片分析时，在下极板左右两边缘贴上聚酰亚胺胶带，然后在电极区域覆上上极板，在上下极板构成的空间内填入二甲基硅油，从而构建一个封闭且低吸附的反应空间。

4.如权利要求1所述的一种基于数字微流控技术的全自动细胞dna与蛋白质相互作用分析方法，其特征在于：通过dmf软件对液滴的精确操控，使得整个分析过程均在芯片上、下极板构成的空间内以自动化的方式进行。

技术总结
一种基于数字微流控技术的全自动细胞DNA与蛋白质相互作用分析方法，包括以下步骤：1)DMF芯片的制备；2)细胞捕获；3)抗体孵育；4)pA‑Tn5标记；5)片段富集和文库构建。本发明通过程序化操纵液滴的分配、移动和混合，可在单个DMF芯片上集成并自动化整个工作流程；通过构建超疏水界面，减少多步磁分离过程中的核酸吸附，有效提高细胞利用率和降低分析的起始细胞数量，从而提高检测灵敏度；通过构建封闭的亚微升反应空间，可以提高参与反应的DNA片段的有效浓度，隔绝外源性污染物，并将试剂消耗量降低了12倍。

技术研发人员：杨朝勇,李铭殷,许醒,那行
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/18