一种表达N-糖基化重组蛋白的工程菌株及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，特别涉及一种表达n-糖基化重组蛋白的工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、大肠埃希菌于1885年首次被分离和描述，是哺乳动物结肠中无处不在的“居民”，也是研究得最好的模式生物之一。大肠杆菌因其快速生长和成熟的工程技术而成为代谢工程广泛使用的平台，因其具有易于进行基因水平上的操作、遗传背景清楚、培养成本低等优点一直作为表达外源基因的首选，也成为很多研究者们进行糖蛋白生产的选择。目前常用的工程菌大肠埃希菌主要来自于菌株k-12和b。虽然大肠埃希菌本身体内不存在糖基化途径，但在2002年，wacker等将空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni,c.jejuni)来源的pgl基因簇及目的蛋白acra转移至大肠埃希菌并检测到了糖蛋白的表达，证实了寡糖基转移酶pglb在糖基化过程中的重要作用，由此在大肠埃希菌中工程化生产糖蛋白成为可能，也为大批量生产n-糖基化修饰的治疗性蛋白药物和糖蛋白疫苗开辟了新的道路。

2、w3110是k-12的衍生菌株，消除了f和lambda，是一种经过较少改造的野生型大肠杆菌菌株且相对遗传稳定，其lac调节子由laczya操纵子及其抑制因子laci基因组成。因其基因组上含有编码β-半乳糖苷酶的lacz基因(gene id:945006)，诱导时β-半乳糖苷酶会大量分解培养基中的乳糖，导致受体模式蛋白糖基化不完全。

3、启动子是基因转录的开关，在调节基因表达水平和重组代谢工程表达水平方面发挥着重要作用。根据启动子的作用方式及功能可将其分为：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。启动子在质粒载体中，通过影响转录的强度和转录持续时间，进而影响蛋白质产量。为了提高糖基化效率，我们在四糖合成途径的基础上进一步增加了启动子并将其整合至野生型菌株w3110基因组，来调控寡糖基转移酶及四糖合成基因簇。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种表达n-糖基化重组蛋白的工程菌株及其构建方法和应用，为了在后续的实验中可以便捷地替换启动子，且防止在二次基因重组过程中将插入的目的基因簇消除，本发明通过大肠杆菌crispr/cas9双质粒系统peccas/pecgrna，对w3110基因组进行改造，使其能够构建四糖糖链合成途径，进而构建表达n-糖基化重组蛋白的工程菌株。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案进行实现：

3、第一方面，本发明提供了含有四糖合成基因的靶基因片段，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、第二方面，本发明提供一种携带上述基因的重组质粒。

5、第三方面，本发明提供了一种包含上述的重组质粒的重组工程菌。

6、进一步地，所述重组工程菌为大肠埃希菌。

7、进一步地，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌w3110。

8、第四方面，本发明提供了一种重组工程菌株的构建方法，将上述的含有四糖合成基因的靶基因片段与pecgrna-n20质粒共同转入含有peccas质粒的大肠埃希菌感受态细胞中，挑取阳性单克隆，消除仅含有pecgrna-n20质粒和peccas质粒的重组菌，得到重组工程菌。

9、进一步地，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌w3110。

10、进一步地，消除仅含有pecgrna-n20质粒和peccas质粒的重组菌的过程为：将阳性克隆依次分别接种到含有kan+鼠李糖的lb培养基中和含有蔗糖lb培养基中。

11、进一步地，所述的n20的核苷酸序列如seq id no.2所示。

12、进一步地，所述的转入的方式为电转化法，电压为1800v，时间为5ms。

13、进一步地，所述的重组工程菌中转入了携带糖基化受体蛋白基因的质粒。

14、进一步地，所述的糖基化受体蛋白包括fn33.4.4。

15、第四方面，本发明提供了所述的重组工程菌在生产n-糖基化重组蛋白中的应用。

16、本发明以四糖合成模块为例，主要包含鳆发光杆菌jt-ish-145的α-2，6-唾液酸转移酶plst6(genbank：ab306315.1)和ncbi上提供的neubca基因簇序列(genbank：af400048.1)的质粒pig6-sia(genbank:mk-721873)为基础载体，引入含有流感嗜血杆菌(haemphilus inflenzae)来源的糖基转移酶lsgcdef基因簇(genbank:m94855,1)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)来源的寡糖翻转酶pglk基因(gene id：905421)、寡糖转移酶pglb基因(gene id：905417)的四糖合成途径替换唾液酸合成途径。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

18、本发明以野生型菌株w3110为改造宿主，基于crispr技术对大肠埃希菌进行改造，通过crispr/cas9双质粒系统peccas/pecgrna构建重组菌株，之后通过更换启动子，实现对大肠埃希菌基因组多种方式的调控，可使靶蛋白得到更好的表达，为后续对其他模块的优化提供理论基础。

技术特征：

1.一种含有四糖合成基因的靶基因片段，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

2.一种携带权利要求1所述的基因的重组质粒。

3.一种包含权利要求2所述的重组质粒的重组工程菌。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠埃希菌。

5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌w3110。

6.一种重组工程菌的构建方法，将权利要求1所述的含有四糖合成基因的靶基因片段与pecgrna-n20质粒共同转入含有peccas质粒的大肠埃希菌感受态细胞中，挑取阳性单克隆，消除仅含有pecgrna-n20质粒和peccas质粒的重组菌，得到重组工程菌。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌w3110；消除仅含有pecgrna-n20质粒和peccas质粒的重组菌的过程为：将阳性克隆依次分别接种到含有kan+鼠李糖的lb培养基中和含有蔗糖lb培养基中；所述的n20的核苷酸序列如seqid no.2所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的转入的方式为电转化法，电压为1800v，时间为5ms。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的重组工程菌中转入了携带糖基化受体蛋白基因的质粒。

10.权利要求3-5任一项所述的重组工程菌、权利要求6-9任一项所述的构建方法获得的重组工程菌在生产n-糖基化重组蛋白中的应用。

技术总结
本发明公开了一种表达N‑糖基化重组蛋白的工程菌株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明将四糖合成基因与pEcgRNA‑N20质粒共同转入含有pEcCas质粒的大肠埃希菌感受态细胞中，挑取阳性单克隆，消除仅含有pEcgRNA‑N20质粒和pEcCas质粒的重组菌，得到重组工程菌，本发明的构建方法简单易行、效率高，所得到的重组工程菌株W3110删除lacZ位点同时整合入lsgCDEF基因簇以构建类人源化四糖链合成代谢途径，转入了携带糖基化受体蛋白基因的质粒，可用于N‑糖基化重组蛋白的表达。该方法可在大肠埃希菌体内快速实施，稳定性好，为其他模块化途径提供了技术平台。

技术研发人员：丁宁,高玉亭,胡学军,宋钇潼,吴宇航,吴琼,张小梅,郑洋
受保护的技术使用者：大连大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/23