一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒及植物组织疏水蛋白的提取方法与流程

本发明涉及植物生物的，具体涉及一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒及植物组织疏水蛋白的提取方法。

背景技术：

1、蛋白质是生命活动的物质基础，对人体健康以及生理代谢都起着重要的作用。从食源来分，蛋白质可分为动物蛋白和植物蛋白。营养学上普遍认为动物蛋白的营养价值高于植物蛋白，源于动物蛋白大都富含人体所需的全部氨基酸，且吸收率显著高于植物蛋白，但近年来研究发现，植物蛋白对人体健康发挥着动物蛋白无可比拟的性能优势。植物蛋白的生产成本远低于动物蛋白，对环境的影响更小。植物蛋白具有降低胆固醇含量、预防心血管疾病等作用，可以降低过多食用动物蛋白导致的肥胖、高血压、心脏病等病症的风险。因此，更多地利用优质植物蛋白资源、加快植物蛋白开发意义重大。

2、在另一方面，研究植物蛋白的人员中，有大多数研究的是植物组织可溶性蛋白，对于不溶性植物蛋白，也就是疏水蛋白研究较少。随着植物组织蛋白研究的深入，可溶性蛋白研究已经进入一个较高的发展阶段，植物组织疏水蛋白逐渐进入研究人员的视野，但其疏水特性，在提取上要么提取不充分，提取效率低，要么提取杂质多，从而影响了蛋白质组学的研究与发展，给研究人员研究带来很大困扰。

3、因此，如何开发一种提取效率高，杂质含量少的植物组织疏水蛋白提取试剂盒及提取方法，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒，提取效率高，杂质含量少。

2、本发明的目的之二在于提供一种植物组织疏水蛋白的提取方法，提取方法简单，效率高，杂质含量少。

3、本发明实现目的之一所采用的方案是：一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：除杂液1、除杂液2、提取剂1、提取剂2、分离液；

4、所述提取剂1为十二烷基磺酸钠，所述提取剂2为berol 532，分离液为水饱和的正丁醇溶液；使用时，提取体系中，十二烷基磺酸钠和berol 532的浓度比为(1～1.2)：(0.9～1.1)。

5、优选地，使用时，提取体系中十二烷基磺酸钠的终浓度为1wt％-1.2wt％，berol532的终浓度为0.9wt％-1.1wt％。

6、优选地，所述除杂液1为甲醇，所述除杂液2为丙酮。

7、本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述试剂盒的植物组织疏水蛋白的提取方法，包括以下步骤：

8、(1)获得样本粉末；

9、(2)向所述样本粉末中加入所述除杂液1，周期性混匀，后置于2-8℃下离心，固液分离，获得固体1；

10、(3)向所述固体1中加入所述除杂液1，周期性混匀，后置于2-8℃下离心，固液分离，获得固体2；

11、(4)向所述固体2中加入所述除杂液2，混匀静置并孵育，后置于2-8℃下离心，固液分离，获得固体3，并将所述固体3在室温下风干；

12、(5)向所述固体3中加入提取液1进行抽提，抽提完成后加入提取剂2，混匀静置，分成上相1、下相1；

13、(6)取所述上相1液体加入分离液，振荡混匀后静置，分成上相2、下相2，取上相2即为提取的植物疏水蛋白。

14、优选地，所述步骤(1)中，样本粉末为植物的根、茎、叶片、花、果实、种子中的至少一种的粉末。

15、优选地，所述步骤(2)和(3)中，周期性混匀为在20-25℃条件下，间隔25-30s混匀25-30s，周期性涡流20-25°с孵育5分钟。

16、优选地，所述步骤(4)中，混匀静置并孵育的操作为将样品旋转15-30s并置于20-25℃下孵育5分钟。

17、优选地，所述步骤(5)中，提取液1为浓度为1wt％-1.2wt％的十二烷基磺酸钠水溶液，抽提操作为在30-37℃摇床180-200r/min抽提1-1.5h，体系中提取剂2的终浓度为0.9wt％～1.1wt％。

18、优选地，所述步骤(2)中，样本粉末和除杂液1的质量体积比为(0.1～0.2)g：(1～1.5)ml，所述步骤(3)中，固体1和除杂液1的质量体积比为(0.01～0.2)g：(1～1.5)ml，所述步骤(4)中，固体2和除杂液2的质量体积比为(0.01～0.2)g：(1～1.5)ml。

19、优选地，所述步骤(5)中，固体3和提取液1的质量体积比为(0.01～0.2)g：(3～8)ml，所述步骤(6)中，上相1和分离液的体积比为1:4～7。

20、发明人在保证疏水蛋白提取效率和质量的前提前下，开发了本发明的方法，详细原理是：通过除杂液1、除杂液2去除植物细胞中的酚类、单宁类、色素等物质，然后用提取剂1配制的提取液1十二烷基磺酸钠水溶液将样本中的疏水蛋白抽提出来，接着加入提取剂2berol532，与sds组成的双水相体系(分成上下两层)，混匀后将分配到上层溶液中的疏水蛋白分离出来，其中上相中主要为berol 532溶液中富集的疏水蛋白，下相中主要为sds溶液富集的可溶性蛋白，最后用水饱和的正丁醇溶液组成第二个双水相体系(分成上下两层)，混匀静置后取上层，其中上层主要为分离液富集的疏水蛋白。

21、本发明的试剂盒中采用提取剂1和提取剂2得到的提取液1、提取液2组成的双水相体系中，所述sds和berol 532的质量浓度比为(1～1.2)：(0.9～1.1)，若小于1：1.1，则会影响疏水蛋白的分配系数，分配到上层的疏水蛋白比例降低，造成提取蛋白提取效低的不利影响；若所述质量浓度比大于1.2：0.9，则会影响有机试剂对蛋白的沉淀效果，使破碎脂肪细胞释放的蛋白不能完全的沉淀，从而导致蛋白丢失，提取造成蛋白得率低不利影响。

22、本发明的方法成本低且实验技术方法简单，故而，也能被很好的运用于植物生物科学研究。且相比于传统的植物组织疏水蛋白提取方法，不论是在实验流程的简单化、实验成本的低廉化、蛋白提取的得率最大化以及提取质量、适用范围等方面，本发明的试剂盒和方法都有很大的改进和提高。

23、本发明具有以下优点和有益效果：

24、本发明提供的植物疏水组织蛋白提取试剂盒，采用双水相萃取的方法，基于疏水蛋白是由疏水氨基酸组成的小分子量蛋白质，能够有效的将疏水蛋白和可溶性蛋白分开，本发明采用的sds和berol 532配制的提取液形成双水相体系，能有效的将疏水蛋白和可溶性蛋白，分配到上相和下相中，去除下相溶液，可将不需要的可溶性蛋白剔除，通过加入水饱和的正丁醇溶液，再次形成的双水相体系，进一步将疏水蛋白提纯，结合双水相前的除杂，提取步骤，使植物组织疏水蛋白提取得率高，杂质含量少，干扰物质少。

25、本发明的植物疏水组织蛋白的提取方法，方法简单，提取效率高，杂质含量低。

技术特征：

1.一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：除杂液1、除杂液2、提取剂1、提取剂2、分离液；

2.根据权利要求1所述的植物组织疏水蛋白提取试剂盒，其特征在于：使用时，提取体系中十二烷基磺酸钠的终浓度为1wt％-1.2wt％，berol 532的终浓度为0.9wt％-1.1wt％。

3.根据权利要求1所述的植物组织疏水蛋白提取试剂盒，其特征在于：所述除杂液1为甲醇，所述除杂液2为丙酮。

4.一种采用权利要求1～3中任一项所述试剂盒的植物组织疏水蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，样本粉末为植物的根、茎、叶片、花、果实、种子中的至少一种的粉末。

6.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中，周期性混匀为在20-25℃条件下，间隔25-30s混匀25-30s，周期性涡流20-25°с孵育5分钟。

7.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中，混匀静置并孵育的操作为将样品旋转15-30s并置于20-25℃下孵育5分钟。

8.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中，提取液1为浓度为1wt％-1.2wt％的十二烷基磺酸钠水溶液，抽提操作为在30-37℃摇床180-200r/min抽提1-1.5h，体系中提取剂2的终浓度为0.9wt％～1.1wt％。

9.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中，样本粉末和除杂液1的质量体积比为(0.1～0.2)g：(1～1.5)ml，所述步骤(3)中，固体1和除杂液1的质量体积比为(0.01～0.2)g：(1～1.5)ml，所述步骤(4)中，固体2和除杂液2的质量体积比为(0.01～0.2)g：(1～1.5)ml。

10.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中，固体3和提取液1的质量体积比为(0.01～0.2)g：(3～8)ml，所述步骤(6)中，上相1和分离液的体积比为1:4～7。

技术总结
本发明涉及植物生物的技术领域，具体涉及一种植物组织疏水蛋白提取试剂盒及植物组织疏水蛋白的提取方法，包括：除杂液1、除杂液2、十二烷基磺酸钠、Berol 532、水饱和的正丁醇溶液；使用时，提取体系中，十二烷基磺酸钠和Berol 532的浓度比为(1～1.2)：(0.9～1.1)。本发明采用双水相萃取的方法，能够有效的将疏水蛋白和可溶性蛋白分开，本发明采用的SDS和Berol 532配制的提取液形成双水相体系，能有效的将疏水蛋白和可溶性蛋白，分配到上相和下相中，去除下相溶液，可将不需要的可溶性蛋白剔除，通过加入水饱和的正丁醇溶液，再次形成的双水相体系，进一步将疏水蛋白提纯，结合双水相前的除杂。

技术研发人员：冷毅斌,杨飞,丁向阳
受保护的技术使用者：伊莱瑞特（武汉）生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/25