一种无血清LMH细胞培养基及其应用的制作方法

本发明涉及生物，特别是一种无血清lmh细胞培养基及其应用。

背景技术：

1、禽腺病毒4型、8型分别可引起心包积水-肝炎综合征(hhs)和包涵体肝炎(ibh)，严重危害禽类养殖，鸡传染性喉气管炎病毒可引起鸡传染性喉气管炎，鸭呼肠孤病毒可感染鸡、鸭、鹅等禽类，导致病毒性关节炎、矮小综合症、呼吸道病、免疫抑制性疾病和吸收不良综合症等，严重危害养禽业。

2、鸡肝癌细胞(lmh细胞)已被证明可应用于禽腺病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭呼肠孤病毒等禽类病毒的生产，产品所制成的灭活疫苗可用于预防多种疾病。传统的lmh细胞为贴壁培养，所使用的培养基中通常需添加10％血清，然而血清价格昂贵，增加了生产成本，且成分比较复杂，批次间差异大、保存期短，且可能携带动物源性病毒、支原体、衣原体等，增加了产品的质量风险。此外，贴壁培养应用于生产对生产容器的数量有较高的要求，使得成本增加、操作复杂、产品稳定性不佳，难以进行规模放大，因此，需要开发无血清培养基。使用无血清培养基支持lmh细胞高密度悬浮培养，同时支持多种病毒生产，更易规模放大，提高产率。然而，目前lmh细胞无血清培养基报道较少，且使用无血清悬浮培养生产病毒的报道同样较少，本发明提供了可支持lmh细胞高密度悬浮生长的无血清培养基，同时提供了使用本发明无血清培养基生产高滴度禽腺病毒、禽呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种无血清lmh细胞培养基及其应用，可支持lmh细胞悬浮生长，细胞培养操作更简便，同时避免了血清带来的动物源性病毒、支原体等风险，驯化简单。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种无血清lmh细胞培养基，具体组分包括碳水化合物、氨基酸及其盐、维生素及其盐、无机盐、微量元素、脂质、分子化合物添加剂及水解物添加剂。

4、进一步的，所述碳水化合物为包括葡萄糖在内的糖类；

5、所述氨基酸或其盐包括：l-组氨酸、l-缬氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-苏氨酸、l-丝氨酸、l-色氨酸、l-脯氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸、l-酪氨酸二钠盐、l-赖氨酸盐酸盐、l-精氨酸盐酸盐、l-甲硫氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、l-胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、l-甘氨酸、l-丙氨酸、l-苯丙氨酸中的一种或者多种；

6、所述维生素及其盐包括：叶酸、盐酸吡哆醇、烟酰胺、生物素、氯化胆碱、硫辛酸、抗坏血酸、核黄素、钴胺素、泛酸钙、i-肌醇中的一种或多种；

7、所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠中的一种或多种；

8、所述微量元素包括七水合硫酸锌、亚硒酸钠、五水合硫酸铜、钼酸铵、氯化锰中的一种或多种；

9、所述脂类包括亚油酸、胆固醇、生育酚中的一种或多种；

10、所述分子化合物添加剂包括柠檬酸铁、乙醇胺、胸苷、腐胺、次黄嘌呤钠、黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐、丙酮酸钠、草酰乙酸、pluronic f-68中的一种或多种；

11、所述水解物添加剂包括酵母水解物1、酵母水解物2、酵母水解物3中的一种或多种。

12、进一步的，所述无血清lmh细胞培养基的ph为7.1±0.2。

13、本发明还提供了一种所述的无血清lmh细胞培养基悬浮培养lmh细胞的方法，包括以下步骤：

14、在所述的无血清lmh细胞培养基中接种lmh细胞，以提供lmh细胞生长所需营养物，置于37℃，5％co2摇床悬浮培养，摇床转速控制为110-130rpm，达到lmh细胞悬浮培养的目的；

15、上述反应均在摇瓶或生物反应器中进行。

16、本发明还提供了一种所述的无血清lmh细胞培养基在扩增禽腺病毒中的应用，包括以下步骤：

17、在所述的无血清lmh细胞培养基中接种lmh细胞，置于37℃，5％co2摇床培养24-72h后，使用接种时的lmh培养基稀释至细胞密度为2-6×106cells/ml，以moi＝0.0001-1接种禽腺病毒种毒，置于37℃，5％co2摇床培养72-96h后收获，从而获得高滴度禽腺病毒；

18、上述反应均在摇瓶或生物反应器中进行。

19、本发明还提供了一种所述的无血清lmh细胞培养基在扩增禽呼肠孤病毒中的应用，包括以下步骤：

20、在所述的无血清lmh细胞培养基中接种lmh细胞，置于37℃，5％co2摇床培养24-72h后，使用接种时的lmh培养基稀释至细胞密度为2-6×106cells/ml，以moi＝0.0001-1接种禽呼肠孤病毒，置于37℃，5％co2摇床培养24-48h后收获，从而获得高滴度禽呼肠孤病毒；

21、上述反应均在摇瓶或生物反应器中进行。

22、本发明还提供了一种所述的无血清lmh细胞培养基在扩增鸭坦布苏病毒中的应用，包括以下步骤：

23、在所述的无血清lmh细胞培养基中接种lmh细胞，置于37℃，5％co2摇床培养24-72h后，使用接种时的lmh培养基稀释至细胞密度为2-6×106cells/ml，以1％体积比接种鸭坦布苏病毒，置于37℃，5％co2摇床培养24-48h后收获，从而获得高滴度鸭坦布苏病毒；

24、上述反应均在摇瓶或生物反应器中进行。

25、本发明有益效果在于：

26、1.相比较现行常用的含血清培养基而言，本发明的无血清培养基可支持lmh细胞悬浮生长，细胞培养操作更简便，同时避免了血清带来的动物源性病毒、支原体等风险，驯化简单，3-5代即可从贴壁细胞驯化为悬浮细胞，细胞形态均一分散、边缘平整，生长密度大于1×107cells/ml，易规模放大，节省了生产成本；

27、2.利用本发明的无血清培养基可使用lmh细胞生产高滴度的4型或8a型或8b型禽腺病毒；

28、3.利用本发明的无血清培养基可使用lmh细胞生产高滴度的禽呼肠孤病毒；

29、4.利用本发明的无血清培养基可试用lmh细胞生产高滴度的鸭坦布苏病毒。

技术特征：

1.一种无血清lmh细胞培养基，其特征在于，具体组分包括碳水化合物、氨基酸及其盐、维生素及其盐、无机盐、微量元素、脂质、分子化合物添加剂及水解物添加剂。

2.如权利要求1所述的无血清lmh细胞培养基，其特征在于，所述碳水化合物为包括葡萄糖在内的糖类；

3.如权利要求1所述的无血清lmh细胞培养基，其特征在于，所述无血清lmh细胞培养基的ph为7.1±0.2。

4.利用权利要求1-3任一项所述的无血清lmh细胞培养基悬浮培养lmh细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求1-3任一项所述的无血清lmh细胞培养基在扩增禽腺病毒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求1-3任一项所述的无血清lmh细胞培养基在扩增禽呼肠孤病毒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求1-3任一项所述的无血清lmh细胞培养基在扩增鸭坦布苏病毒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别是一种无血清LMH细胞培养基及其应用，本发明所述无血清LMH细胞培养基的具体组分包括碳水化合物、氨基酸及其盐、维生素及其盐、无机盐、微量元素、脂质、分子化合物添加剂及水解物添加剂，相比较现行常用的含血清培养基而言，本发明的无血清培养基可支持LMH细胞悬浮生长，细胞培养操作更简便，同时避免了血清带来的动物源性病毒、支原体等风险，驯化简单，3‑5代即可从贴壁细胞驯化为悬浮细胞，细胞形态均一分散、边缘平整，细胞最高密度大于1×10<supgt;7</supgt;cells/ml，容易放大规模，节省了生产成本。

技术研发人员：王建超,张如悦
受保护的技术使用者：上海杰威医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/23