一种人卵巢组织卵泡分离及收集方法与流程

本发明属于卵泡分离，尤其是涉及一种人卵巢组织卵泡分离及收集方法。

背景技术：

1、目前分离卵泡采用方法主要目前有机械法、酶法和机械-酶结合法。但这些卵泡分离和收集方法存在许多问题：1.机械法将卵巢皮质切为细小碎片后用细针头手动分离卵泡，该方法能保持卵泡基底膜完整性，但从组织中在显微镜下手工剥离出完整的卵泡极耗费时间，对人员操作技术和耐心有极高要求，且获得卵泡效率相对较低；2.酶法卵泡收获率相对机械法较高，但卵泡基底膜易损伤，后续培养卵泡发育欠佳；3.酶法和机械-酶结合法中酶消化终止需使用血清，血清制品成分复杂，引入机体可造成潜在病毒感染或免疫反应；4.卵泡捡拾收集困难、耗时长，经机械切碎和酶消化后的混悬液中含有大量可溶的胶原蛋白、dna碎片、细胞色素等以及大量游离细胞、未彻底消化的组织碎片等固形成成分，导致混悬液浑浊、可见度低，在体视镜下逐一辨认、捡拾卵泡较困难，耗时长。

2、大多数原始卵泡分布在卵巢皮层纤维中，将机械法和酶法相结合，机械切碎和酶消化卵巢组织可获得较高的卵泡回收率和较好的卵泡质量，但无论卵巢组织的利用效率、人工耗费还是收集的卵泡数量以及形态和基底膜完整率等仍然不尽如人意。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提出一种人卵巢组织卵泡分离及收集方法，本发明将机械与酶消化法相结合，采用胶原蛋白酶v和二次筛网过滤等方法，既降低卵泡基底膜损伤、提高完整卵泡回收率，同时也大大提高卵泡收集效率和卵巢组织的利用率。

2、本发明中，所述卵泡分离基于组织切碎机进行卵巢组织切碎后所用消化液为无中性红消化液，并在消化液中添加了0.2mg/ml的胶原蛋白酶v，并采用无血清工作液和二次筛网过滤终止酶消化而进行人卵泡分离和收集。

3、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

4、一种用于人卵巢组织卵泡分离的消化液，包括0.02-0.04mg/ml liberase tm tl、0.2mg/ml胶原酶v和0.2mg/ml脱氧核糖核酸酶i。

5、优选的，脱氧核糖核酸酶i的比活力≥2000单位/mg。

6、优选的，还包括工作液，所述工作液包括如下组分，92％(v/v)mccoy’s5a培养基，5％(v/v)人血清白蛋白(hsa)，1％(v/v)l-谷氨酰胺(glumax)，1％(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂its，0.05mg/ml青链霉素；其中，mccoy’s5a培养基中含25mm hepes。

7、优选的，胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，包括终浓度为10μg/ml人重组胰岛素，5.5μg/ml转铁蛋白和6.7ng/ml亚硒酸；青链霉素的原液中青霉素浓度为10000u/ml，链霉素浓度为10000μg/ml。

8、本发明同时提供一种使用如上所述的消化液进行人卵巢组织卵泡分离及收集的方法，人卵巢组织的消化条件为37℃，5％二氧化碳、100％湿度的培养箱内摇床轻柔震荡消化30-60min。

9、优选的，消化液所用体积按每1.5-2g重量的人卵巢组织用10ml消化液进行计算。

10、优选的，包括如下步骤，1)将切碎的人卵巢组织进行一次消化，得到消化后的卵巢组织碎片-消化液混悬液，用200μm孔径筛网过滤，过滤后的滤液终止酶消化作用；2)将步骤1)过滤后筛网上的卵巢组织碎片进行二次消化；3)将步骤2)二次消化后的卵巢组织碎片-消化液混悬液终止酶消化作用；4)将终止酶消化作用的目标粒径卵泡及组织碎片用工作液重悬并于体视显微镜下行卵泡捡拾。

11、优选的，通过如下方法终止酶消化作用，用50μm孔径筛网过滤，将筛网上截留到的目标粒径卵泡及组织碎片用工作液反复冲洗2-3次。

12、优选的，步骤1)中，人卵巢组织通过如下方法进行机械切碎：将收集的卵巢皮质或髓质组织用组织切碎机在超净工作台上以150次/分钟的切割频率连续切割30min后切成0.3-0.5mm3的组织碎片，切割过程中，每隔3-5min补充工作液，确保卵巢组织保持湿润。采用组织切碎机对卵巢组织进行切碎，大大缩短了组织切碎时间，30分钟内可将4-6g的组织切成0.3-0.5mm3大小的组织碎片。

13、liberasetm tl研究级混合胶原酶含有高度纯化的胶原酶i和胶原酶ii。这两种胶原酶异构体以精确的比例相互混合，并含有低浓度的嗜热菌蛋白酶(一种非梭菌中性蛋白酶)，liberase纯化酶混合物取代传统混合胶原酶，可提高卵巢组织解离的质量和可重复性，提高分离卵泡的活力和功能性。

14、使用胶原酶v，v型胶原分布在细胞周围以及i型胶原的周围，在基膜和结缔组织之间起着桥梁作用，使用胶原酶v可解离基底膜和结缔组织之间的链接，将细胞从i型胶原中释放出来。

15、相对于现有技术，本发明所述的人卵巢组织卵泡分离及收集方法，具有以下优势：

16、(1)本发明所使用的消化液不添加中性红。消化液中添加中性红可使卵泡染成红色，而组织碎片不着色，这一现象使卵泡在从混悬液中分辨和捡拾的过程中容易识别。中性红为亲核性弱碱性化学染料，其阳离子可与带有一定负电荷的活细胞细胞核结合，即使低剂量亦可能对卵泡中卵母细胞染色以及其后期发育潜力造成负面影响。本发明对卵巢组织消化后的混悬液进行了二次过滤和反复漂洗，将卵泡捡拾过程中混悬液里影响显微镜下观察清晰度的物质、细胞以及小粒径组织碎片等冲洗掉，各级卵泡形态即使不经染色亦可在体视显微镜下被清晰的辨认和识别。

17、(2)本发明中，切碎的卵巢组织分两次消化，先用消化液消化30min后，能通过200μm孔径筛网的混悬液终止酶消化作用，避免消化酶长时间作用于卵泡，造成卵泡基底膜和活力损伤；未能通过200μm孔径筛网的较大卵巢组织碎片进行第二次酶消化，以释放组织块中的卵泡，进一步提高卵巢组织利用率和卵泡回收率。

18、(3)本发明中，无血清冲洗液终止酶消化。通常的终止酶消化作用，需加入大剂量的血清以阻断酶对组织的消化作用，本发明中采用二次过滤，50μm筛网可将95％以上消化酶过滤掉，网上滤出的目标粒径卵泡和组织碎片所附着的消化液经2-3次不含消化酶工作液的反复漂洗而清除，达到终止酶消化的目的。

19、(4)本发明中，不同孔径筛网二重过滤。本发明中采用不同孔径筛网分别为200μm和50μm孔径筛网对卵巢组织混悬液进行过滤，在酶消化30min后首先用200μm孔径筛网过滤消化后的混悬液，对大粒径组织进行二次消化，提高卵巢组织利用率和卵泡回收率；过滤后得到的滤液再经50μm孔径筛网二次过滤，并经反复漂洗后，可将目标粒径的游离卵泡和组织碎片表面附着的酶、消化后的胶原蛋白、dna碎片、细胞色素等可溶物以及游离单细胞、<50μm组织碎片以及其他可引起混悬液浑浊、透视度低的物质漂洗掉，50μm筛网上仅余目标粒径的卵泡和组织碎片，重悬后极大改善混悬液在显微镜下的清晰度，提高对高质量卵泡的辨识度和辨识效率，进而提高卵泡的回收质量和回收效率。

技术特征：

1.一种用于人卵巢组织卵泡分离的消化液，其特征在于：包括0.02-0.04mg/mlliberase tm tl、0.2mg/ml胶原酶v和0.2mg/ml脱氧核糖核酸酶i。

2.如权利要求1所述的用于人卵巢组织卵泡分离的消化液，其特征在于：脱氧核糖核酸酶i的比活力≥2000单位/mg。

3.如权利要求1所述的用于人卵巢组织卵泡分离的消化液，其特征在于：还包括工作液，所述工作液包括如下组分，92％(v/v)mccoy’s 5a培养基，5％(v/v)人血清白蛋白(hsa)，1％(v/v)l-谷氨酰胺(glumax)，1％(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂its，1％(v/v)青链霉素；其中，mccoy’s 5a培养基中含25mm hepes。

4.如权利要求4所述的用于人卵巢组织卵泡分离的消化液，其特征在于：胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，包括终浓度为10μg/ml人重组胰岛素，5.5μg/ml转铁蛋白和6.7ng/ml亚硒酸；青链霉素的原液中青霉素浓度为10000u/ml，链霉素浓度为10000μg/ml。

5.一种使用如权利要求1-4任一项所述的消化液进行人卵巢组织卵泡分离及收集的方法，其特征在于：人卵巢组织的消化条件为37℃，5％二氧化碳、100％湿度的培养箱内摇床轻柔震荡消化30-60min。

6.如权利要求5所述的人卵巢组织卵泡分离及收集方法，其特征在于：消化液所用体积按每1.5-2g重量的人卵巢组织用10ml消化液进行计算。

7.如权利要求5所述的人卵巢组织卵泡分离及收集方法，其特征在于：包括如下步骤，1)将切碎的人卵巢组织进行一次消化，得到消化后的卵巢组织碎片-消化液混悬液，用200μm孔径筛网过滤，过滤后的滤液终止酶消化作用；2)将步骤1)过滤后筛网上的卵巢组织碎片进行二次消化；3)将步骤2)二次消化后的卵巢组织碎片-消化液混悬液终止酶消化作用；4)将终止酶消化作用的目标粒径卵泡及组织碎片用工作液重悬并于体视显微镜下行卵泡捡拾。

8.如权利要求7所述的人卵巢组织卵泡分离及收集方法，其特征在于：通过如下方法终止酶消化作用，用50μm孔径筛网过滤，将筛网上截留到的目标粒径卵泡及组织碎片用工作液反复冲洗2-3次。

9.根据权利要求7所述的人卵巢组织卵泡分离及收集方法，其特征在于：步骤1)中，人卵巢组织通过如下方法进行机械切碎：将收集的卵巢皮质或髓质组织用组织切碎机在超净工作台上以150次/分钟的切割频率连续切割30min后切成0.3-0.5mm3的组织碎片，切割过程中，每隔3-5min补充工作液，确保卵巢组织保持湿润。

技术总结
本发明提供了一种人卵巢组织卵泡分离及收集方法，组织切碎机进行卵巢组织切碎后用消化液进行消化，所用消化液为无中性红消化液，并在消化液中添加了0.2mg/mL的胶原蛋白酶V等物质，同时采用无血清工作液和二次筛网过滤终止酶消化而进行人卵泡分离和收集。本发明既降低卵泡基底膜损伤、提高完整卵泡回收率，同时也大大提高卵泡收集效率和卵巢组织的利用率。

技术研发人员：成俊萍,刘俐伶,蒋燕明,罗婵,毛献宝,李政达,覃捷,何冰,滕敏
受保护的技术使用者：广西壮族自治区人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/7/15