一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法

本发明涉及医学细胞领域，特别涉及一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法。

背景技术：

1、目前，全球有数亿人口正遭受肝病的困扰，作为一种危害性极大的常见疾病，肝病一直受到世界卫生组织的高度关注并作为重要公共卫生问题对待，因此开展肝病相关的研究具有重要意义，其中体外细胞实验是肝病研究过程中不可或缺的步骤，肝脏提取的多种原代细胞可广泛用于各种急慢性肝病的基础研究。

2、肝脏包含实质成分和非实质成分，肝脏实质成分主要指肝细胞，是行使肝功能的基本单位；肝脏非实质成分是肝脏中起着连接、支撑肝实质成分的组织结构，其不具备行使肝功能的作用；除此之外，肝脏中富含大量的免疫细胞，特别是在小鼠肝脏中免疫细胞富集的现象则更加明显，包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、树突状细胞、γδt细胞、库弗细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤t细胞等，它们共同参与肝脏的免疫调节。当肝脏受到病原微生物、药物、化学和酒精等因素刺激时均可引起肝细胞损伤，进而激活肝内免疫应答反应，导致包括病毒性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎和酒精性肝炎在内的多种肝脏疾病。为了阐明各种肝病的发病机理，探索预防和治疗肝病的方法，研究肝脏相关原代细胞就显得尤为重要，它是肝脏相关基础研究、疾病治疗和药物监测等应用的重要工具。

3、肝脏原代细胞分离法雏形最早可追溯至1970年的“两步胶原酶灌注法”，其利用插管技术连接小鼠肝门静脉/下腔静脉，通过给肝脏灌注胶原酶以逐渐消化肝脏并获取游离的细胞悬液，该方法自问世以来便在世界范围内得到广泛应用，尽管目前针对“两步胶原酶灌注法”不断进行了优化方案，但其核心框架依然未变。现如今，针对肝脏中一种原代细胞(如肝细胞)的分离方法均能达到较满意的效果，此时要想获得肝脏中其他类型的细胞(如肝星状细胞、淋巴细胞)就需要再次牺牲额外的实验动物，这无疑会导致实验动物的滥用，不符合“实验动物保护的3r保护”原则。

4、因此，本发明正是基于以上研究背景，对小鼠肝脏逆行灌注消化法进行不断探索和优化措施，实现了同时分离肝脏中肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞等多种原代细胞，分离出的肝细胞可用于肝损伤的相关研究，得到的肝星状细胞可用于肝纤维化疾病的研究，而提取的肝单个核细胞则可用于免疫介导的肝病的研究，从而为相关肝病体外实验的开展奠定坚实基础。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

3、本发明提供一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，具体包括如下步骤：

4、s1.配制胶原酶溶液：分析天平称取0.0625g iv型胶原酶加入100ml的hanks培养液中充分混匀配制成浓度为0.05％的胶原酶溶液，使用0.22μm过滤器进行无菌处理，随后放置于37℃水浴锅中至少温育20-30min以备用；

5、s2.密度梯度分离液配制：取percoll原液并摇匀，将9份体积percoll原液与1份体积10×pbs浓缩液充分混匀制成等渗percoll；将10×pbs浓缩液稀释10倍后制成pbs，取2份体积pbs与1份体积等渗percoll配制成33％percoll；

6、s3.小鼠肝脏灌洗：对小鼠肝脏处理后，用50ml注射器吸取预热好的胶原酶溶液并连接输液针，推注胶原酶溶液对肝脏进行灌洗，直至胶原酶溶液充满肝脏，在胶原酶作用下肝实质成分将被消化，结构丧失，仅残留纤维结缔组织和肝包膜；

7、s4.肝脏分化一次处理：用镊子撕破肝包膜，用移液器吸取培养液轻轻吹打并混匀细胞，将所得细胞悬液反复经200目细胞过滤筛过滤；重复过滤步骤2-3次以获得细胞悬液；

8、s5.将过滤后的细胞悬液包含肝脏中所有类型的细胞，将其收集于50ml离心管中，在4℃条件下自然沉降15-30min使其分层；

9、s6.肝细胞分离获取：在步骤s5中的下层沉淀主要为肝细胞，掺杂少量血细胞，将其收集于15ml离心管中，用pbs重悬，50×g离心3min，弃上清，pbs重悬后离心洗涤两次；

10、s7.肝星状细胞分离获取：在步骤s5中的上层悬液富含肝单个核细胞，收集于15ml离心管中，在4℃条件下250×g离心5min，弃上清，pbs洗两次后得沉淀，用5ml的33％percoll将上述沉淀重悬，室温，850×g离心30min，分离结束；离心管中细胞悬液分为上下两层，上层为肝星状细胞，用移液器将其吸出转移至另一15ml离心管，pbs重悬，4℃条件，250×g离心5min，弃上清，pbs洗两次后得沉淀，用培养基重悬用于后续培养；

11、s8.肝单个核细胞分离获取：在步骤s7分离出的下层沉淀主要为肝单个核细胞，用适量pbs重悬并反复经300目细胞过滤筛过滤，250×g离心5min，弃上清，加5ml红细胞裂解液，在4℃裂解15min后，250×g离心5min，弃上清，pbs洗两次后得沉淀，用培养基重悬用于后续培养。

12、作为本发明的一种优选技术方案，步骤s3中，小鼠可采用麻醉昏迷或死亡时间不超过5min的实验小鼠；灌洗流程可循环4-5次，消化肝脏25-30min。

13、作为本发明的一种优选技术方案，步骤s4中，200目细胞过滤筛的孔径为70μm；在细胞悬液具有残留的细小组织块时，可用无菌玻璃棒研磨。

14、作为本发明的一种优选技术方案，步骤s8中，300目细胞过滤筛的孔径为40μm；pbs洗两次后得沉淀时，若有红细胞残留，再次加5ml红细胞裂解液，在4℃裂解15min后，250×g离心5min，弃上清，循环处理直至沉淀为纯白。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

16、1：本发明基于注射器连接输液针进行灌洗作业，所提供方法可以同时分离小鼠肝脏中三种原代细胞，一定程度上避免实验动物的滥用，并且避免了不同实验个体差异带来的误差，且只需经过一次传代培养后细胞数量即明显增加，这相比于从小鼠肝脏提取原代细胞更简单。

17、2：本发明提供了一种便捷、高效、经济的小鼠肝脏多种原代细胞同步分离的方法，适用于一般实验室的小鼠体内相关细胞分离及进一步培养。通过对细胞鉴定结果进行分析，实现了同时分离肝脏中肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞等多种原代细胞，分离出的各种原代细胞可用于急慢性肝病的研究，工艺方法具有更方便更快捷的技术效果。

技术特征：

1.一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，其特征在于，步骤s3中，小鼠可采用麻醉昏迷或死亡时间不超过5min的实验小鼠；灌洗流程可循环4-5次，消化肝脏25-30min。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，其特征在于，步骤s4中，200目细胞过滤筛的孔径为70μm；在细胞悬液具有残留的细小组织块时，可用无菌玻璃棒研磨。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，其特征在于，步骤s8中，300目细胞过滤筛的孔径为40μm；pbs洗两次后得沉淀时，若有红细胞残留，再次加5ml红细胞裂解液，在4℃裂解15min后，250×g离心5min，弃上清，循环处理直至沉淀为纯白。

技术总结
本发明属于细胞技术领域，涉及小鼠肝脏多种原代细胞的分离，是一种用于小鼠肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞分离和纯化的简易可行方案，适用于一般实验室的小鼠体内相关细胞分离及进一步培养。本发明所提供的方法核心是在小鼠下腔静脉插管的基础上使用胶原酶溶液进行灌注消化，随后经过一系列分离和连续纯化步骤，实现小鼠肝脏中肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞等多种原代细胞的获取。该发明一定程度上克服了目前肝脏细胞分离方法单一，兼顾了高效、经济，又能避免实验动物滥用的特点，从而为相关肝病体外实验的开展奠定坚实基础。

技术研发人员：甘建,纪翠锋,全无暇,王江涛,缪延栋,时巍巍
受保护的技术使用者：滨州医学院烟台附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/7/18