球孢白僵菌LNTL-1及其在生物防治中的应用的制作方法

本发明属于农业生物，具体涉及一种球孢白僵菌菌株lntl-1及其在西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱生物防治上的应用。

背景技术：

1、在农业生产过程特别是蔬菜种植中，有多种害虫为害，危害作物较重的有西花蓟马frankliniella occidentalis(pergande)、美洲斑潜蝇liriomyza sativae(blanchard)、番茄潜叶蛾tuta absoluta(meyrick)、烟粉虱bemisia tabaci(gennadius)等世界性入侵害虫，这些害虫寄主广、食性杂、防治难度大，不仅能直接为害寄主植物，导致植物生长不良，造成作物减产，甚至绝收；还能传播多种植物病毒，造成大面积的病毒病，导致巨大的农业经济损失。

2、目前应用化学药剂防治较多，害虫对多种药剂均表现出高水平耐药性，导致防治效率下降，化学农药剂量增加。

3、昆虫病原真菌对寄主的侵染一般要经历10个阶段，即分生孢子的附着，萌发，穿透表皮，增殖，产生毒素，寄主死亡，菌丝入侵所有器官，菌丝穿透表皮，产生分生孢子，分生孢子扩散。球孢白僵菌(beauveria bassiana)作为一种优良的虫生真菌，对多种害虫具有高致病性，具有对人畜无害、安全、无污染的特点，因此球孢白僵菌被广泛地应用到害虫的综合治理体系中。

技术实现思路

1、本申请结合实际生物防治的经验，不同球孢白僵菌菌株间毒力差异很大，且害虫在接触真菌后到致死前有很长的存活时间，仍然能对作物造成严重为害，因此选择毒力强、致死时间短的菌株尤为重要；其次是菌株的产孢量，一株高毒力菌株必须要有较高的产孢量，从而降低生产成本，才能最终实现大规模的工业化生产和商业应用。因此，本申请针对以上2个方面进行室内评估，以期筛选出高效的球孢白僵菌菌株，最终应用于害虫的综合治理体系中。具体的，

2、本申请提供一种球孢白僵菌(beauveria bassiana(balsamo)vuillemin)菌株lntl-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40508，保藏日期为2023年02月27日，属于丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

3、本发明还提供一种上述菌株的孢子粉的制备方法，所述制备方法包括将上述菌株进行培养。

4、优选的，所述培养包括以下步骤：

5、1)、制备活化的孢子粉：将球孢白僵菌lntl-1接种于萨氏培养基sday上，所述萨氏培养基sday含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖和2％的琼脂。优选的，培养条件为保持温度25-27℃，培养7-10d,生产出活化的lntl-1的孢子粉。

6、更优选的，所述孢子粉的制备方法进一步包括：

7、将上述活化的lntl-1的孢子粉经过2)、一级种子液培养、3)、二级种子液培养、4)、固相发酵和5)、孢子粉的干燥和收获步骤制备而成。

8、进一步优选的，

9、2)、一级种子液的培养

10、取上述活化的lntl-1的孢子粉，接入萨氏培养液sdy得到种子液，所述萨氏培养液sdy含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖，种子液的初始孢子浓度为1.0×106个·ml-1，在25℃、120r·min-1条件下振荡培养48hr，得到一级种子液。

11、3)、二级种子液的培养

12、将一级种子液按5％的接种量接入萨氏培养液sdy培养液，在7升液体发酵罐中培养。加入发酵液体积的0.5％豆油，培养温度为25-27℃，转速为100-200rpm，初始溶氧量为50％以上。培养40hr后得到二级种子液。

13、4)、固相发酵

14、用开水浸泡大米30分钟，捞出控去多余水份，121℃灭菌30分钟后，按100g大米加入15ml二级种子液的比例接菌，发酵器具为20×30cm的塑料袋。接种后铺放于25-26℃的条件下培养7-10d。

15、5)、孢子粉的干燥和收获

16、固相发酵后的物料置于30℃下干燥3d，再用孢子收获机，例如mycoharvestercompany,uk的收获机，收获孢子粉。

17、本发明还提供一种菌株lntl-1的孢子粉，所述孢子粉由上述制备方法制备而成。

18、本发明还提供一种上述菌株或孢子粉在制备生防制剂中的应用。

19、优选的，所述菌株或孢子粉和其他的杀虫剂联合应用。

20、本发明还提供一种生防制剂，所述生防制剂包括上述菌株或孢子粉。

21、优先的，所述生防制剂还包括其他的杀虫剂。

22、本发明还提供一种上述生防制剂在防治靶标昆虫的应用，所述靶标昆虫为西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱。

23、本发明还提供一种防治靶标昆虫的方法，所述方法包括向易感作物喷洒上述生防制剂，所述靶标昆虫为西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱。

24、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

25、本发明的有益效果：

26、本发明筛选得到的菌株lntl-1对四种常见世界性入侵害虫，包括西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和烟粉虱bemisia tabaci(gennadius)的侵染率显著高于其他菌株，可以提高对害虫的致死率，从而减少害虫对农作物的侵害。

27、本发明筛选得到的菌株lntl-1对上述四种害虫相对于其他菌株致死时间较短，在侵染率高的同时，致死时间缩短，可以进一步减少害虫对农作物的为害量。

28、本发明筛选得到的菌株lntl-1相对于其他菌株有较高的产孢量，从而降低生产成本，最终实现大规模的工业化生产和商业应用。

29、菌株保藏信息：

30、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；

31、保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

32、保藏号：cgmcc no.40508；

33、保藏日期：2023年02月27日；

34、分类命名：球孢白僵菌beauveria bassiana

技术特征：

1.一种球孢白僵菌(beauveria bassiana(balsamo)vuillemin)菌株lntl-1，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40508，保藏日期为2023年02月27日，属于丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

2.一种菌株lntl-1的孢子粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求1所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana(balsamo)vuillemin)菌株lntl-1进行培养。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养包括1)、制备活化的孢子粉：将菌株lntl-1接种于萨氏培养基sday上进行培养，所述萨氏培养基sday为1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖和2％的琼脂孢。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括将球孢白僵菌lntl-1接种于萨氏培养基sday上，保持温度25-27℃，培养7-10d，生产出活化的lntl-1的孢子粉。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将活化的lntl-1的孢子粉经过2)、一级种子液培养、3)二级种子液培养、4)、固相发酵和5)、孢子粉的干燥和收获步骤。

6.一种菌株lntl-1的孢子粉，其特征在于，所述孢子粉由权利要求2-5任一制备方法制备而成。

7.权利要求1所述的菌株lntl-1或权利要求6所述的孢子粉在制备生防制剂中的应用。

8.一种生防制剂，其特征在于，所述生防制剂包括权利要求1所述的菌株lntl-1或权利要求6所述的孢子粉。

9.权利要求8所述生防制剂在防治靶标害虫的应用，所述靶标害虫为西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱。

10.一种防治靶标害虫的方法，所述方法包括向易感作物喷洒权利要求8所述生防制剂，所述靶标害虫为西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱。

技术总结
本发明涉及一种球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin)LNTL‑1，由所述菌株制备的孢子粉，以及所述菌株或孢子粉在制备生防制剂中的应用，所述菌株对于西花蓟马、美洲斑潜蝇、番茄潜叶蛾和/或烟粉虱有显著短的致死中时，以及显著提高的侵染率，包含所述菌株或孢子粉的生防制剂可用于上述害虫的防治。

技术研发人员：王登杰,钟绍忆,梁兴慧,毕司进,王海鸿
受保护的技术使用者：绵阳市农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/8/15