牦牛耳成纤维细胞线粒体分离方法及其在制备抗衰老产品中的应用

本发明涉及线粒体移植应用，具体涉及牦牛耳成纤维细胞线粒体分离方法及其在制备抗衰老产品中的应用。

背景技术：

1、线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为"power house"。

2、线粒体是能量产生和细胞代谢的关键，在衰老过程中起着重要作用。因此，靶向线粒体功能障碍被视为对抗年龄相关衰退的有希望的策略。线粒体移植代表了抗衰老研究领域的创新方法。将健康的线粒体转移到具有功能失调的线粒体的细胞中，目标是恢复或恢复这些细胞的健康和功能。

3、但是，要想进行线粒体移植必然面临一个问题就是线粒体的来源问题。目前现有的相关研究中，是通过使用与宿主相同物种的年轻个体线粒体，通过注射的方式进行移植来抵抗衰老。但是对于人类或其他大部分动物来说，获取同物种的线粒体渠道非常受限。

技术实现思路

1、为提供一种新的线粒体获取途径，本发明提供了牦牛耳成纤维细胞线粒体分离方法及其在制备抗衰老产品中的应用，本发明获得的牦牛耳成纤维细胞线粒体通过异种移植，发现其对小鼠具有抗衰老的作用，同时有增强小鼠生殖能力的作用。

2、本发明提供了一种牦牛耳成纤维细胞线粒体的分离方法，包括如下步骤：取离体的牦牛耳组织，处理成碎块，消化，然后于2000-3000g、18-20℃离心5-10min，清洗后于2000-3000g、18-20℃离心5-10min，加入胎牛血清，含双抗的dmem，重悬后于37±2℃、4-6％co2条件下进行培养获得牦牛耳成纤维细胞；

3、将获得的牦牛耳成纤维细胞在37±2℃下用0.2-0.3％的胰蛋白酶/edta消化，然后用pbs洗涤，进行线粒体分离，获得牦牛耳成纤维细胞线粒体。

4、在一些实施例中，一种牦牛耳成纤维细胞线粒体的分离方法，包括以下步骤：取离体的牦牛耳组织，剪碎后进行消化，然后于2000-3000g、18-20℃离心5-10min，清洗后于2000-3000g、18-20℃重复离心5-10min，加入10％胎牛血清，2％双抗的dmem，重悬后于37℃、5％ co2条件下进行培养获得牦牛耳成纤维细胞；

5、将获得的牦牛耳成纤维细胞在37℃下用0.25％的胰蛋白酶/edta消化，然后用pbs(浓度为0.01m，ph＝7.4)洗涤，用线粒体分离试剂盒进行线粒体分离，获得牦牛耳成纤维细胞线粒体。

6、本发明分离的到的牦牛耳成纤维细胞线粒体对于小鼠来说是异种线粒体，目前相关研究中线粒体移植仅用于相同物种之间，通过使用与宿主相同物种的年轻个体线粒体进行移植取得想要的技术效果，而异种之间线粒体移植是有难度的，而本发明分离的到的牦牛耳成纤维细胞线粒体实现了异种线粒体移植，且发现牦牛耳成纤维细胞线粒体移植小鼠后能起到抗衰老的作用以及提高生殖功能的作用。

7、本发明还提供了一种上述方法制备得到的牦牛耳成纤维细胞线粒体。

8、本发明还提供了一种包含所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体的线粒体制剂。

9、进一步地，所述线粒体制剂由生理盐水重悬牦牛耳成纤维细胞线粒体制得。

10、本发明还提供了一种牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂在制备抗衰老药物中的应用。

11、进一步地，所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂用于制备抗老年小鼠衰老药物。

12、进一步地，所述牦牛耳成纤维细胞线粒体使用剂量为10mg/kg体重。

13、进一步地，所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂用于制备提高生殖能力的药物。

14、进一步地，所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂用于制备增强中年小鼠的精子活力的药物，也能用于制备增强中年小鼠后代生长速度的药物。

15、进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

16、进一步地，所述辅料为海藻酸钠、壳聚糖、聚乙烯醇、麸胺、醛基化葡聚糖、己二酸二酰肼、吐温60、月桂酰胺丙基甜菜碱、栀子苷和栀子油等中的任意一种或多种的组合。

17、进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和辅料。

18、进一步地，所述载体、赋形剂、稀释剂和辅料包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。

19、进一步地，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内；例如通过静脉全身递送、局部注射递送或口服递送到体内；可选地经由静脉内、经皮、鼻内、黏膜、口服或其他递送方法进行施用；这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

21、1、本发明分离的到的牦牛耳成纤维细胞线粒体实现了异种线粒体移植，且发现牦牛耳成纤维细胞线粒体移植小鼠后能起到抗衰老的作用以及提高生殖功能的作用，本申请提取分离的异种线粒体移植到了小鼠体内产生线粒体异质型小鼠，为异种线粒体用于人和其它动物提供了理论和实验基础。

22、2、另一个挑战与转移的外源线粒体与宿主细胞的相容性有关。本发明通过技术手段确认了提取的线粒体dna与受者细胞的核dna之间具有良好的相容性。这种相容性对于线粒体在新细胞环境中的正常功能至关重要。

23、3、本发明分离的线粒体能够达到优良的治疗效果，不会对宿主产生负面影响。

24、4、更广泛的线粒体来源：牦牛主要分布于中国青藏高原及其周围海拔3000米以上的高寒地区，生命力顽强。由于长期生活在高原低氧地区，牦牛的线粒体功能非常强大。牦牛线粒体作为一种新的异种线粒体来源，为新的线粒体获取方式提供了新思路，尤其是在现有线粒体来源受限的情况下。

25、5、更高的移植效率：实验结果显示牦牛线粒体在宿主组织中的保留率与宿主年龄成反比，特别是在脑、下丘脑和肌肉等关键器官中保留率较高，这表明本发明在特定组织中可能具有更高的移植效率。

26、6、显著的治疗效果：牦牛线粒体对器官的atp水平、ros产生和mtdna拷贝数的改善显示出显著的治疗效果，尤其是在老年动物中效果更加显著。

27、7、改善运动能力和延缓衰老过程：实验表明牦牛线粒体能够改善老年小鼠的运动能力，并延缓衰老过程。

28、8、提高生殖能力：牦牛线粒体能增强中年小鼠的精子活力和后代的生长速度，这可能为治疗某些生殖问题提供新的策略。

技术特征：

1.一种牦牛耳成纤维细胞线粒体的分离方法，其特在于，包括如下步骤：

2.一种权利要求1所述的分离方法制得的牦牛耳成纤维细胞线粒体。

3.一种包含权利要求2所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体的线粒体制剂。

4.根据权利要求3所述的线粒体制剂，其特征在于，所述线粒体制剂由生理盐水重悬牦牛耳成纤维细胞线粒体制得。

5.一种权利要求2所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或权利要求3-4任一项所述的线粒体制剂在制备抗衰老药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂用于制备抗老年小鼠衰老的药物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的线粒体制剂用于制备提高生殖能力的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的牦牛耳成纤维细胞线粒体或线粒体制剂用于制备增强中年小鼠的精子活力的药物，也能用于制备增强中年小鼠后代生长速度的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述辅料为海藻酸钠、壳聚糖、聚乙烯醇、麸胺、醛基化葡聚糖、己二酸二酰肼、吐温60、月桂酰胺丙基甜菜碱、栀子苷和栀子油等中的任意一种或多种的组合。

技术总结
本发明涉及线粒体分离技术领域，具体公开了牦牛耳成纤维细胞线粒体分离方法及其在制备抗衰老产品中的应用，利用牦牛耳组织为原材料，通过消化、离心、培养获得牦牛耳成纤维细胞，然后通过线粒体分离试剂盒进行线粒体分离，获得牦牛耳成纤维细胞线粒体。本发明分离获得的牦牛耳成纤维细胞线粒体能用于异种移植，发现其移植后具备抗衰老作用和增强生殖功能的作用，因此，能用于制备抗衰老和提高生殖能力的药物。

技术研发人员：赵兴波,李文鹏
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/23