PCSK9基因重组AAV载体、高脂血症动物模型的构建方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其是涉及一种pcsk9基因重组aav载体、高脂血症动物模型的构建方法和应用。

背景技术：

1、如下陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

2、以动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ascvd)为主的心血管疾病是导致人类死亡主要原因，其防控面临严峻挑战。血脂是血清中的胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)和类脂等的总称，与临床密切相关的血脂成分包括tc和tg。高脂血症，尤其低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)是ascvd的致病性危险因素，其他含有载脂蛋白apob-100(apob)的脂蛋白，包括富含tg的脂蛋白及其残粒，也参与ascvd的病理生理过程。

3、建立理想的模仿类似于人类血脂谱的高脂血症实验模型，是研究血脂代谢紊乱发病机制的重要工具，也是降脂治疗药物研发的关键环节。通过基因工程技术陆续开发出了apoe-/-、ldlr-/-、apoe/ldlr双敲除等被广泛应用的基因修饰动物模型。然而，apoe-/-缺乏近似人类的血脂谱、ldlr-/-呈现较弱脂代谢异常，而且上述模型是模型动物自身的脂代谢基因进行遗传操作，并不能有效模拟人类高脂血症的生理和病理特征，制约高脂血症的机制研究和降脂治疗药物的研发。因此，如何改进高脂血症实验模型是目前亟待解决的问题。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种嵌合型aav8载体，其能够高效靶向转导肝脏组织。

2、本发明的第二目的在于提供一种pcsk9基因重组aav载体，其能够高效靶向转导肝脏组织，并使pcsk9基因长期稳定表达。

3、本发明的第三目的在于提供一种高脂血症动物模型的构建方法可自发形成显著的高胆固醇血症和高甘油三酯血症表型。

4、本发明的第四目的在于提供上述pcsk9基因重组aav载体和构建方法在药物筛选或制备用中的应用，助力靶向人的pcsk9抗体、小分子基因治疗药物等降脂治疗药物的开发。

5、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

6、第一方面，提供了一种嵌合型aav8载体，所述嵌合型aav8载体为aav8经衣壳蛋白修饰而得，所述衣壳蛋白修饰包括将aav8衣壳蛋白vp1上的磷脂酶a2结构域替换为aav2的磷脂酶a2结构域。

7、可选的实施方式中，所述嵌合型aav8载体携带外源基因。

8、可选的实施方式中，所述外源基因由cba启动子驱动表达。

9、第二方面，还提供了一种pcsk9基因重组aav载体，该pcsk9基因重组aav载体为携带pcsk9基因的第一方面的嵌合型aav8载体。

10、可选的实施方式中，所述pcsk9基因为人源pcsk9基因。

11、第三方面，还提供了一种高脂血症动物模型的构建方法，该构建方法包括将第二方面的pcsk9基因重组aav载体导入受试动物。

12、可选的实施方式中，所述受试动物是野生型。

13、可选的实施方式中，所述受试动物包括哺乳动物；

14、可选的实施方式中，所述受试动物包括小鼠；

15、可选的实施方式中，pcsk9基因重组aav载体的导入剂量为2×1011vg。

16、可选的实施方式中，所述高脂血症包括血清总胆固醇和甘油三酯水平升高；

17、可选的实施方式中，所述高脂血症包括血清总胆固醇和甘油三酯中血浆脂蛋白乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和高密度脂蛋白升高。

18、第四方面，还提供了第一方面的嵌合型aav8载体，第二方面的pcsk9基因重组腺相关病毒载体，或第三方面的高脂血症动物模型的构建方法在如下任一项中的应用：

19、(ⅰ)筛选或制备用于预防或治疗高脂血症的药物中的应用；

20、(ⅱ)筛选或制备用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用；

21、(ⅲ)筛选或制备药物，所述药物用于降低血液中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平中至少一种。

22、可选的实施方式中，上述(ⅰ)～(ⅲ)中任一项的药物分别独立的以pcsk9、低密度脂蛋白受体和载脂蛋白apob-100中的至少一种为干预靶标。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、本发明提供的嵌合型aav8载体(aav8.p)通过将aav8的磷脂酶a2结构域替换为aav2型，使其能够高效靶向转导肝脏组织。基于该嵌合型aav8载体的pcsk9基因重组aav载体(aav8.p-pcsk9)对肝脏具备高效、靶向、长期稳定表达以及安全的优势。

25、本发明提供的高脂血症动物模型的构建方法通过导入aav8.p-pcsk9载体将pcsk9基因靶向导入动物肝脏，规避pcsk9转基因动物复杂的遗传操作、费力耗时的繁殖工作，有助于降低成本、缩短实验周期；该构建方法克服了apoe或ldl-r敲除模式动物的局限性，并可用于涉及与多种基因敲除动物品系相结合的实验研究，节省基因修饰动物与apoe/ldlr敲除动物杂交所需时间，成为构建高脂血症模型的一种快速且通用的方法，能够助力新型降脂治疗药物的开发。该构建方法建立了一种快速、简便、经济、通用且有效模拟高脂血症临床表型的动物模型的新途径。

26、本发明发现导入aav8.p-pcsk9载体可诱导受试动物呈现典型的血清tc和tg同时升高的混合型高脂血症表型，血脂组分分析显示tc和tg中血浆脂蛋白：乳糜微粒cm、极低密度脂蛋白vldl、中密度脂蛋白idl、低密度脂蛋白ldl以及高密度脂蛋白hdl均显著升高，为研究高脂血症发病机制以及筛选或制备靶向pcsk9的小分子治疗药物、抗体等降脂治疗药物的研发提供科学依据和理想的实验动物模型；为筛选预防或治疗高脂血症(包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高ldl-c血症以及混合型高脂血症)的以pcsk9作为干预靶标的药物或制剂提供了理想的临床前实验动物模型，该模型具有经济、稳定、便捷、高效的优点。

27、当aav8.p-pcsk9载体携带人源pcsk9基因时，构建的动物模型可有效模拟人类高脂血症的临床表型，其快速、简便、经济有效的构建方法具有良好的应用前景和转化价值。

技术特征：

1.嵌合型aav8载体，其特征在于，所述嵌合型aav8载体为aav8经衣壳蛋白修饰而得，所述衣壳蛋白修饰包括将aav8衣壳蛋白vp1上的磷脂酶a2结构域替换为aav2的磷脂酶a2结构域。

2.根据权利要求1所述的嵌合型aav8载体，其特征在于，所述嵌合型aav8载体携带外源基因；

3.pcsk9基因重组aav载体，其特征在于，为携带pcsk9基因的权利要求1或2所述的嵌合型aav8载体。

4.根据权利要求3所述的pcsk9基因重组aav载体，其特征在于，所述pcsk9基因为人源pcsk9基因；

5.高脂血症动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将权利要求3或4所述的pcsk9基因重组aav载体导入受试动物。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述受试动物是野生型；

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述受试动物包括小鼠；

8.根据权利要求5～7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述高脂血症包括血清总胆固醇和甘油三酯水平升高；

9.权利要求1或2所述的嵌合型aav8载体，或权利要求3或4所述的pcsk9基因重组aav载体，或权利要求5～8任一项所述的高脂血症动物模型的构建方法在如下任一项中的应用：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，(ⅰ)～(ⅲ)中任一项的药物分别独立的以pcsk9、低密度脂蛋白受体和载脂蛋白apob-100中的至少一种为干预靶标。

技术总结
本发明提供了一种PCSK9基因重组AAV载体、高脂血症动物模型的构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。该PCSK9基因重组AAV载体为携带PCSK9基因的嵌合型AAV8载体，该嵌合型AAV8载体经衣壳蛋白修饰，包括AAV8的磷脂酶A2结构域替换为AAV2型。该高脂血症动物模型的构建方法通过PCSK9基因重组AAV高效靶向转导肝脏组织，并使PCSK9基因长期稳定表达，使动物模型形成显著的高胆固醇血症和高甘油三酯血症表型，制备得到高脂血症动物模型，具有经济、稳定、便捷、高效的优点，和良好的应用前景和转化价值。

技术研发人员：陈邦党,陈小翠
受保护的技术使用者：新疆医科大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/7/15