一种用于多个基因片段组装的试剂及其组装方法

本发明涉及基因工程学，具体涉及一种用于多个基因片段的试剂及其组装方法。

背景技术：

1、将一个或多个dna片段插入到各种类型的载体(如最常用的质粒载体)中，是分子生物学和基因工程中常用的操作。在代谢工程和合成生物学研究如火如荼的当下，这些操作的应用则更为广泛。最经典的操作是利用dna限制性内切酶将这些片段和载体处理成相互兼容的粘性末端，再在dna连接酶的作用下，使这些片段连接起来，这样的操作是直接和有效的。然而，当待插入的片段较长或数量较多时，这样的操作方法就变得步骤十分繁琐和效率低下。而且，还有可能因为这些序列中包含了大量的酶切位点，出现没有合适的酶可以使用的情形，使这些操作无法进行。

2、为此，研究者提出了不同的解决方法，例如不依赖于序列和连接的克隆技术(slic)和gatewaytm克隆技术等。这些方法也都曾被广泛使用。然而，这些方法都有一些明显的缺陷，限制了他们的更广泛使用。例如，在slic方法中，由于在体外时形成的重组质粒事实上并没有共价闭合，是仅靠相邻片段上互补的单链之间的氢键相互作用维系的，因此，稳定性较差。slic方法克隆的产物，不仅不能用于电击转化以获得较高的转化率，也不能用于在42℃下的化学转化。gatewaytm克隆技术不仅需要多个不同用途的质粒载体，而且用于扩增的引物较长且设计也比较复杂，对于测序结果的分析也不如其他克隆方法直接。专利产品gibson组装试剂，利用t5 dna外切酶、dna聚合酶及dna连接酶，可以在同一体系内实现多个dna片段的组装，是目前市面上销售的此类产品的主要代表，而且需要在较高的温度下(50℃)进行。

技术实现思路

1、为此，本发明提供一种用于多个基因片段组装的试剂及其制备方法，在保证其效率高和操作简便的前提下，该试剂可以使组装过程在更低的温度(37℃)下进行，进一步降低对实验设备的要求，以解决背景技术中提出的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种用于多个基因片段组装的试剂，包括原料和缓冲液体系，所述原料包括t5dna外切酶、dna聚合酶、dna连接酶以及dntp，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。

3、优选的，使用购买t5exo，taq聚合酶，t4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得混合缓冲液。

4、优选的，t5dna外切酶是能从双链dna的磷酸基团一端以外切方式降解其中一条dna链的任意酶；dna聚合酶为具有按磷酸基团一端至羟基一端方向以核苷酸为原料将dna单链进行延伸的任何酶；dna连接酶为可催化相邻核苷酸上的羟基及磷酸形成磷脂键的任意酶。

5、优选的，t5dna外切酶的浓度为1u/ml-10u/ml；dna聚合酶的活性为10u/ml-30u/ml；dna连接酶的活性达到500u/ml-700u/ml；dntp包括相同浓度的datp,dttp,dctp,dgtp，各dntp的终浓度为0.1mm-1.0mm。

6、优选的，所述试剂至少包括有peg3350、peg6000、或peg8000中的一种、两种或三种的组合，且终浓度为0.1％-20％。此处，3350,6000，及8000为peg的分子量。

7、优选的，所述试剂还包括为tris-ac、tris-hcl、mg(ac)2、kac、kcl、atp、dtt及纯水中的一种或多种的组合。

8、本发明公开了一种用于多个基因片段的组装方法，使用上述的用于多个基因片段组装的试剂进行基因片段组装，组装步骤包括：

9、step5.1试剂体积与dna样品总体积按照比值k,将试剂与待组装的至少2个dna片段进行均匀混合，得到混合液；

10、step5.2将得到的混合液在30℃-45℃下孵育30min，得到反应液。

11、优选的，k的值是根据dna样品中所含dna片段种类数n进行调整的：当n＝2时，k＝1；n＝3、4时，k＝2；n＝5及以上时，k＝3。

12、本发明公开了用于多个基因片段的组装方法，得到的反应液用于不同常用宿主制备的化学感受态细胞的转化。

13、本发明公开的用于多个基因片段的组装方法应用于基因工程以及基因组编辑等操作中重组质粒载体的构建。

14、本发明具有如下优点：

15、本发明利用t5 dna外切酶可以从双链dna中两条链的磷酸基团一端开始沿磷酸基团至羟基方向以外切方式降解dna的特性，dna聚合酶能够从羟基一端沿磷酸基团至羟基方向催化形成dna链的特性，以及t4 dna连接酶可以连接相邻的核苷酸上的磷酸基团和羟基形成磷脂键的特性，在30-45℃的条件下，将反应体系中的多个dna片段根据各末端序列之间的一致性关系，按照预设的顺序组装起来，最终形成靠共价键连接的分子，本发明提供该试剂的配方及制备方法，使相关操作摆脱对限制性内切酶的依赖，可以将外源片段插入到载体的任意位点，具有很好的通用性，以实现多个基因片段的高效和快速组装，在保证其效率高和操作简便的前提下，该试剂可以使组装过程在更低的温度(37℃)下进行，进一步降低对实验设备的要求。

技术特征：

1.一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：包括原料和缓冲液体系，所述原料包括t5 dna外切酶、dna聚合酶、dna连接酶以及dntp，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：将购买或配制t5 exo、taq聚合酶、t4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得的混合缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：t5 dna外切酶是能从双链dna的磷酸基团一端以外切方式降解其中一条dna链的任意酶；dna聚合酶为具有按磷酸基团一端至羟基一端方向以核苷酸为原料将dna单链进行延伸的任何酶；dna连接酶为可催化相邻核苷酸上的羟基及磷酸形成磷脂键的任意酶。

4.根据权利要求3所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：t5 dna外切酶的浓度为1u/ml-10u/ml；dna聚合酶的活性为10u/ml-30u/ml；dna连接酶的活性达到500u/ml-700u/ml；dntp包括相同浓度的datp,dttp,dctp,dgtp，各dntp的终浓度为0.1mm-1.0mm。

5.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：所述试剂至少包括peg3350、peg6000、或peg8000中的一种、两种或三种的组合，且终浓度为0.1％-20％。

6.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：所述组装试剂还包括为tris-ac、tris-hcl、mg(ac)2、kac、kcl、atp、dtt及纯水中的一种或多种的组合。

7.一种用于多个基因片段的组装方法，其特征在于：使用权利要求1-6任一项所述的用于多个基因片段组装的试剂进行基因片段组装，组装步骤包括：

8.根据权利要求7所述的一种用于多个基因片段组装方法，其特征在于，k的值是根据dna样品中所含dna片段种类数n进行调整的：当n＝2时，k＝1；n＝3、4时，k＝2；n＝5及以上时，k＝3。

9.根据权利要求7所述的一种用于多个基因片段的组装方法得到的反应液用于不同常用宿主制备的化学感受态细胞的转化。

10.根据权利要求7所述的一种用于多个基因片段的组装方法应用于基因工程以及基因组编辑等操作中重组质粒载体的构建。

技术总结
本发明公开了一种用于多个基因片段组装的试剂及其组装方法，具体涉及基因工程学技术领域，该试剂包括原料和缓冲液体系，所述原料包括T5DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶以及dNTP，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。将购买或配制T5exo、Taq聚合酶、T4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得的混合缓冲液。本发明提供该试剂的配方及组装方法，摆脱对限制性内切酶的依赖，可以将外源片段插入到载体的任意位点，具有很好的通用性，以实现多个基因片段的高效和快速组装，在保证其效率高和操作简便的前提下，该试剂可以使组装过程在更低的温度下进行，进一步降低对实验设备的要求。

技术研发人员：王天文,方天志,邵雅萍,薛正莲
受保护的技术使用者：安徽工程大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/18