酶法合成具有3’-O-磷酸修饰的核酸的方法与流程

本发明涉及非天然核苷酸合成领域，具体而言，涉及一种酶法合成具有3’-o-磷酸修饰的核酸的方法。

背景技术：

1、在现有技术中，寡核苷酸的合成目前主要依赖于亚磷酰胺固相合成法，但合成长度大于200nt的核酸链仍具有很高的难度，同时合成的准确性不能满足目前市场对寡核苷酸产品的需求，一般合成＞200nt的核酸，其理论成功率最高37%。同时现有技术合成寡核苷酸的过程使用大量的有机溶剂，涉及有毒试剂的使用，具有多大的pmi（pmi：产品生产全过程中所有物质的质量总和与目标产物质量的比值），以合成20nt序列寡核苷酸为例，每千克产品产生约4000千克废物，同时也会面临放大生产受限等瓶颈，随着寡核苷酸药物的普遍应用，对寡核苷酸的需求日益增长，因此开发寡核苷酸合成的新方法是非常必要的。

2、酶法催化合成寡核苷酸是绿色的合成工艺，具有条件温和、快速偶联、无危险废物产生的优点，可合成更长链的寡核苷酸，因此具有较好的应用前景。在使用酶法合成寡核苷酸过程中，需要对核苷酸或寡核苷酸的3’端进行可逆保护，以实现合成序列的特异性，避免错误序列的合成，在酶催化过程完成之后3’端保护基团需要能无痕去除。在核酸聚合酶以无模板依赖的方式合成寡核苷酸的过程中，需要对核苷酸的3’端进行可逆封端，在偶联反应完成后需要去除3’端封端以进入下一轮的合成中，因此核酸链或核苷酸的3’端可逆封端对寡核苷酸的酶法合成是十分重要的。然而目前尚无对寡核苷酸或核苷酸进行3’端酶法可逆基团修饰的报道，现有技术主要手段是化学法合成带有3’端可逆修饰的核苷酸，合成工艺较为繁琐。对核酸链的3’端进行可逆修饰仍处于技术空白状态。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种酶法合成具有3’-o-磷酸修饰核酸的方法，以添补现有技术中难以通过酶催化合成带有3’-o-磷酸修饰的核酸的技术空白。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种酶法合成具有3’-o-磷酸修饰的核酸的方法，该方法包括：利用磷酸激酶催化长度为1nt的核酸单体或长度≥2nt的寡核苷酸链，获得3’-o-磷酸的核酸单体或寡核苷酸链。

3、进一步地，核酸单体包括核苷或核苷酸；核苷由碱基和五碳糖组成；核苷酸由碱基、五碳糖和磷酸组成；五碳糖包括核糖或脱氧核糖；碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；核苷酸中的磷酸的数量为1个、2个或3个，对应的核苷酸分别为核苷一磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。

4、进一步地，寡核苷酸链为长度≥2nt的rna链或dna链。

5、进一步地，寡核苷酸链的长度为2-20nt。

6、进一步地，磷酸激酶包括apsk酶或dpck酶。

7、进一步地，dpck酶为seq id no：1- seq id no：10中任一所示的蛋白；apsk酶为seq id no：11- seq id no：20中任一所示的蛋白。

8、进一步地，核酸单体包括天然核酸单体或非天然核酸单体，天然核酸单体的五碳糖为核糖或脱氧核糖，非天然核酸单体的五碳糖为含有修饰的核糖或脱氧核糖，或具有非天然骨架的、由5个c原子组成的非天然单糖。

9、进一步地，寡核苷酸链包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。

10、进一步地，非天然寡核苷酸链由非天然核苷酸组成。

11、进一步地，方法包括：利用atp或多聚磷酸盐，以及磷酸激酶，以核酸单体或寡核苷酸链为底物进行催化，获得3’-o-磷酸的核酸单体或寡核苷酸链。

12、应用本发明的技术方案，利用磷酸激酶能够催化核酸单体或寡核苷酸链，获得3’-o-磷酸的核酸单体或寡核苷酸链，实现对于含有3’-o-磷酸修饰的核酸的酶法制备，此种酶法制备相较于现有技术中的化学合成，具有生产规模、收率、成本、环保、安全性等诸多优势。

技术特征：

1.一种酶法合成具有3’-o-磷酸修饰的核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸单体包括核苷或核苷酸；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸链为长度≥2nt的rna链或dna链。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸链的长度为2-20nt。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸激酶包括apsk酶或dpck酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述dpck酶为seq id no：1- seq id no：10中任一所示的蛋白；

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸单体包括天然核酸单体或非天然核酸单体，所述天然核酸单体的五碳糖为核糖或脱氧核糖，所述非天然核酸单体的五碳糖为含有修饰的核糖或脱氧核糖，或具有非天然骨架的、由5个c原子组成的非天然单糖。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸链包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非天然寡核苷酸链由所述非天然核苷酸组成。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用atp或多聚磷酸盐，以及所述磷酸激酶，以所述核酸单体或所述寡核苷酸链为底物进行催化，获得所述3’-o-磷酸的核酸单体或寡核苷酸链。

技术总结
本发明提供了一种酶法合成具有3’‑O‑磷酸修饰的核酸的方法，该方法包括利用磷酸激酶催化长度为1nt的核酸单体或长度≥2nt的寡核苷酸链，获得3’‑O‑磷酸的核酸单体或寡核苷酸链。能够添补现有技术中难以通过酶催化合成带有3’‑O‑磷酸修饰的核酸的技术空白，适用于非天然核苷酸合成领域。

技术研发人员：洪浩,詹姆斯·盖吉,张娜,焦学成,刘芳,王召帅,胡蝶,项悦皓,庞会宁,马翠萍,马苁淙,崔丽心,朱文轩,赵晓岚
受保护的技术使用者：天津凯莱英生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5