一种叶菌唑半抗原、抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及叶菌唑检测，尤其涉及一种叶菌唑半抗原、抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、叶菌唑属于三唑类杀菌剂，是一种麦角甾醇生物合成中c-14脱甲基化酶抑制剂，主要通过抑制麦角甾醇生物合成，破坏真菌细胞膜透性和膜结构，抑制孢子的形成和菌丝生长。叶菌唑具有高内在活性，可以通过叶片进入植物组织深层，杀灭深层组织中的真菌。叶菌唑防治谱广，主要通过叶面喷洒，防治麦类赤霉病和叶绣病、玉米锈病、大豆锈病、油菜籽菌核病等。此外叶菌唑具有生长调节作用，同时也可以达到使油菜籽增产的效果。但由于其直接喷洒于作物上，叶菌唑大量使用容易污染水源。

2、《gb2763-2021食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中要求：小麦样品中叶菌唑的最大残留限量为0.1mg/kg。目前，国内外检测叶菌唑主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域被广泛应用，相对于仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为叶菌唑残留研究提供了一条新的分析检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种叶菌唑半抗原、抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种叶菌唑半抗原，所述叶菌唑半抗原的结构式为

4、

5、本发明还提供了所述的叶菌唑半抗原的制备方法，包含如下步骤：

6、1)将叶菌唑和7-溴庚酸独立的溶于有机溶剂，得到叶菌唑溶液和7-溴庚酸溶液；

7、2)将叶菌唑溶液和7-溴庚酸溶液进行反应，得到叶菌唑半抗原。

8、作为优选，步骤1)中所述叶菌唑和有机溶剂的摩尔体积比为8～12mmol：9～11ml，7-溴庚酸和有机溶剂的摩尔体积比为12～15mmol：1～3ml，叶菌唑和7-溴庚酸的摩尔比为1：1.2～1.5。

9、作为优选，步骤1)所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；步骤2)所述反应的温度为70～90℃，反应的时间为8～12h。

10、本发明还提供一种包含所述的叶菌唑半抗原的叶菌唑抗原，所述叶菌唑抗原为叶菌唑半抗原和载体蛋白的偶联物；

11、所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

12、本发明还提供了所述的叶菌唑抗原的制备方法，包含如下步骤：

13、①将叶菌唑半抗原、偶联剂和溶剂进行活化反应，得到半抗原溶液；

14、②将载体蛋白、缓冲液和半抗原溶液进行偶联反应，得到叶菌唑抗原。

15、作为优选，步骤①所述偶联剂为n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑中的一种或几种；所述溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；

16、步骤②所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为0.04～0.06mol/l。

17、作为优选，步骤①所述活化反应的温度为20～30℃，活化反应的时间为2～4h；

18、步骤②所述偶联反应的温度为3～5℃，偶联反应的时间为11～13h。

19、本发明还提供了一种所述的叶菌唑抗原为免疫原制备得到的叶菌唑单克隆抗体。

20、本发明还提供了一种包括叶菌唑抗原和叶菌唑单克隆抗体的检测叶菌唑的试纸条，所述试纸条包括结合物释放垫、反应膜；

21、所述反应膜上具有包被有所述的叶菌唑抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；

22、所述结合物释放垫上喷涂有叶菌唑单克隆抗体-胶体金标记物。

23、本发明的有益效果包括以下几点：

24、1)本发明制得的试纸条灵敏度高、检测速度快、操作简单、成本低、适用于大批量样本的筛查，能够满足食品监管部门开展现场监控和检测工作。

25、2)本发明制得的试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将叶菌唑单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，使得样品中的叶菌唑在流动过程中与叶菌唑单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物，样品中的药物与反应膜检测线上的叶菌唑抗原竞争结合叶菌唑单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有叶菌唑残留，检测结果准确。

技术特征：

1.一种叶菌唑半抗原，其特征在于，所述叶菌唑半抗原的结构式为

2.权利要求1所述的叶菌唑半抗原的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

3.根据权利要求2所述的叶菌唑半抗原的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述叶菌唑和有机溶剂的摩尔体积比为8～12mmol：9～11ml，7-溴庚酸和有机溶剂的摩尔体积比为12～15mmol：1～3ml，叶菌唑和7-溴庚酸的摩尔比为1：1.2～1.5。

4.根据权利要求2或3所述的叶菌唑半抗原的制备方法，其特征在于，步骤1)所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；步骤2)所述反应的温度为70～90℃，反应的时间为8～12h。

5.一种包含权利要求1所述的叶菌唑半抗原的叶菌唑抗原，其特征在于，所述叶菌唑抗原为叶菌唑半抗原和载体蛋白的偶联物；

6.权利要求5所述的叶菌唑抗原的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

7.根据权利要求6所述的叶菌唑抗原的制备方法，其特征在于，步骤①所述偶联剂为n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑中的一种或几种；所述溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；

8.根据权利要求7所述的叶菌唑抗原的制备方法，其特征在于，步骤①所述活化反应的温度为20～30℃，活化反应的时间为2～4h；

9.一种权利要求5所述的叶菌唑抗原为免疫原制备得到的叶菌唑单克隆抗体。

10.一种包括叶菌唑抗原和叶菌唑单克隆抗体的检测叶菌唑的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括结合物释放垫、反应膜；

技术总结
本发明属于叶菌唑检测技术领域。本发明提供了一种叶菌唑半抗原、抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用。所述叶菌唑半抗原的结构式为本发明制得的试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将叶菌唑单克隆抗体‑胶体金标记物固定于结合物释放垫上，使得样品中的叶菌唑在流动过程中与叶菌唑单克隆抗体‑胶体金标记物结合，形成药物‑抗体‑胶体金标记物，样品中的药物与反应膜检测线上的叶菌唑抗原竞争结合叶菌唑单克隆抗体‑胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有叶菌唑残留，灵敏度高、检测速度快、检测结果准确，并且操作简单，成本低、适用于大批量样本的筛查。

技术研发人员：刘冰冰,邓乾民
受保护的技术使用者：北京普赞生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/19