一种高灵敏度溴氰菊酯抗免疫复合物多肽及其在免疫检测中的应用

本发明属于生物，具体涉及与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽，及其在酶联免疫吸附分析和侧流免疫层析方法上的应用。

背景技术：

1、溴氰菊酯(deltamethrin)属于ii型拟除虫菊酯类农药，具有高效、广谱的特点，被广泛用于农业和兽医领域。由于有机磷等高毒农药逐渐被禁用或限用，溴氰菊酯在农业生产上的用量逐年增长，此外，溴氰菊酯具有持久的残留活性，在农产品中常被检出，膳食暴露风险大。人体接触溴氰菊酯可能导致急性健康影响，如共济失调、皮炎和呕吐。溴氰菊酯对食蚜性瓢虫捕食者的种群和斑马鱼鱼鳔的发育产生负面影响，对鹌鹑等非靶标生物具有免疫毒性、神经毒性和氧化毒性，危及农业景观中生态系统功能。因此，世界卫生组织国际癌症研究机构在2017年将溴氰菊酯列入3类致癌物清单。我国也对溴氰菊酯在食品中最大残留限量(gb2763-2021)做出了明确规定，小麦、大白菜和苹果中的最大残留限量分别为0.5、0.5和0.1mg/kg。因此，对环境和食品中溴氰菊酯残留进行准确、快速的检测对保障食品和环境安全具有重要意义。

2、基于抗原-抗体识别的免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，已成为农产品质量安全保障体系的重要组成部分。与竞争性免疫分析模式相比，非竞争模式通常表现出高灵敏度、宽线性范围以及对分析物变异的低敏感性，提高了检测的准确性和可靠性。然而，小分子化合物仅具有单个抗原决定簇，传统的双抗体夹心法对于检测农药等小分子化合物并不适用。目前，可基于抗独特性抗体、抗异型抗体、抗体可变区片段和抗免疫复合物多肽来开发用于小分子的非竞争免疫分析法。其中，抗免疫复合物多肽具有制备周期短，易于修饰以增强其结合特异性、稳定性或生物活性等特性，备受研究者青睐。虽然抗免疫复合物多肽在多种农药中已得到广泛应用，但目前尚未有溴氰菊酯的抗免疫复合物多肽的相关报道。

3、近年来，检测农药残留的侧流免疫层析方法成为研究热点，因其可在5-10分钟内获得可视化的检测结果，而且无需专用设备和人员，具有快速、简便和经济的特点，在现场筛查方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。然而，目前仅有两篇基于溴氰菊酯抗体开发的侧流免疫分析法的报道，灵敏度分别为5μg/ml和1μg/ml，未达到残留检测要求，如中国小麦和白菜的最大残留限量为0.5mg/kg。与人工抗原相比，多肽作为检测试剂可显著提升检测方法的灵敏度，且合成肽具有批次间差异小、纯度高和稳定性好的优点，然而目前尚未开发以多肽为核心试剂检测溴氰菊酯残留的侧流免疫层析试纸条。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽，及其在酶联免疫吸附分析和免疫层析试纸条上的应用。

2、本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

3、一种与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的高灵敏度多肽，其中，所述多肽的序列为seq id no.3为所示的氨基酸序列。

4、其中，所述的多肽两端的半胱氨酸巯基氧化形成二硫键而被环化。

5、其中，所述的多肽的制备方法包括如下步骤：

6、1)溴氰菊酯抗免疫复合物多肽的淘选：采用固相淘选技术和混合淘选策略，通过在酶标板上包被抗溴氰菊酯单克隆抗体，然后加入溴氰菊酯，形成溴氰菊酯免疫复合物靶分子，淘选混合的噬菌体展示多肽库(环七、八、九和十肽库)，酸性洗脱结合的噬菌体，测定洗脱物的滴度后扩增用于下一轮淘选，通过降低靶分子包被浓度，提高洗涤能力依次增加淘选轮次的选择压力，以获得高亲和力的噬菌体多肽。

7、2)噬菌体酶联免疫吸附分析方法(phage-elisa)鉴定阳性克隆：在第三轮淘选的滴度平板上随机挑选24个单克隆进行phage-elisa鉴定，sanger测序特异性结合靶分子的阳性克隆，对具有独特序列的阳性克隆进行棋盘滴定实验确定最佳的抗体包被浓度和噬菌体投入量，进而测定系列溴氰菊酯浓度下的信号值，结果通过origin拟合非线性方程分析，得到不同噬菌体多肽的灵敏度。

8、3)固相合成无噬菌体形式的多肽：在氨基酸序列为seq id no.3～seq id no.19的17种抗免疫复合物多肽中，序列为cyfdgawyac(seq id no.3)的多肽在phage-elisa中检测溴氰菊酯的灵敏度最高，通过标准酰胺合成法获得无噬菌体形式多肽，此外，在序列c端加入间隔臂gggss和用于引入生物素(biotin)修饰的赖氨酸(k)促进该多肽的应用，因此固相合成序列为cyfdgawyacgggssk-biotin，且两端半胱氨酸氧化成环的多肽。

9、其中，所述的溴氰菊酯免疫复合物是抗溴氰菊酯单克隆抗体与溴氰菊酯结合形成的复合物。

10、其中，所述的抗溴氰菊酯单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。

11、其中，所述的重链可变区具有seq id no.1的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有seq id no.2的氨基酸序列。

12、其中，所述的抗溴氰菊酯单克隆抗体包括鼠源igg亚型的重链恒定区和轻链恒定区。

13、本发明的第二方面在于，提供编码上述与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的高灵敏度多肽的基因，其中，所述的基因如seq id no.20所示的核苷酸序列。

14、本发明的第三方面在于，提供一种试剂盒，包括上述与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽。

15、本发明的第四方面在于，提供上述与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽或其基因，或试剂盒在非诊断检测溴氰菊酯中的应用。

16、其中，所述的非诊断检测溴氰菊酯中的应用包括但不限于酶联免疫吸附分析方法、免疫层析分析方法。

17、其中，所述的检测方法包括如下步骤：

18、(1)利用上述多肽制备溴氰菊酯抗免疫复合物多肽探针；

19、(2)利用山羊抗小鼠igg(h+l)抗体，兔抗链霉亲和素多克隆抗体组装免疫层析试纸条；

20、(3)将待检测样品的提取液，溴氰菊酯抗免疫复合物多肽探针，以及抗溴氰菊酯单克隆抗体混合均匀，滴加到试纸条上，8分钟后观察结果，若试纸条c、t线均显色则表明检测结果为阳性，若只有c线显色则表明检测结果为阴性，若c线不显色则说明试纸条失效。

21、本发明具有以下有益效果：

22、1)新颖：首次报道了能够与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽；

23、2)实用：利用本发明提供的多肽，可以建立检测溴氰菊酯的非竞争免疫分析方法；

24、3)灵敏度高：基于抗免疫复合物多肽建立的溴氰菊酯非竞争酶联免疫吸附分析的信号半饱和浓度为1.49ng/ml，比已报道的溴氰菊酯酶联免疫吸附分析的灵敏度提升了4.8倍；基于抗免疫复合物多肽建立的溴氰菊酯侧流免疫层析试纸条的最低检测限为6.25ng/ml，比现有的溴氰菊酯免疫层析试纸条最低检测限降低了16倍。

技术特征：

1.一种与溴氰菊酯免疫复合物特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为seqid no.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽两端的半胱氨酸残基之间形成二硫键而被环化。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的溴氰菊酯免疫复合物由抗溴氰菊酯单克隆抗体与溴氰菊酯反应形成的复合物。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述的抗溴氰菊酯单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区具有seq id no.1的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有seq id no.2的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述的抗溴氰菊酯单克隆抗体包括鼠源igg亚型的重链恒定区和轻链恒定区。

6.编码权利要求1所述的多肽的基因。

7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于，所述的基因如seq id no.20所示的核苷酸序列。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的多肽。

9.权利要求1或2所述的多肽，或权利要求6或7所述的基因，或权利要求8所述的试剂盒在非诊断检测溴氰菊酯中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测方法包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种高灵敏度的溴氰菊酯抗免疫复合物多肽，以及所述多肽在溴氰菊酯残留检测的非竞争性侧流免疫层析方法中的应用。本发明通过混合淘选噬菌体展示环七、八、九和十肽库，成功获得了17种溴氰菊酯抗免疫复合物多肽，均特异性结合溴氰菊酯单克隆抗体与溴氰菊酯形成的免疫复合物。序列为CYFDGAWYAC的多肽在非竞争性噬菌体酶联免疫吸附分析方法中的半饱和浓度为1.49ng/mL，灵敏度比基于包被原的竞争性酶联免疫吸附分析方法提高了209倍，且高于目前所报道的其他溴氰菊酯免疫检测方法。此外，本发明还涉及将固相合成的多肽应用于非竞争性侧流免疫层析试纸条，实现溴氰菊酯残留的快速检测。通过生物素‑链霉亲和素系统，C端生物素修饰的抗免疫复合物多肽与胶体金标记的链霉亲和素结合，制备了胶体金标记抗免疫复合物多肽探针，山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体和兔抗链霉亲和素多克隆抗体分别作为检测(T)线和控制(C)线，实现了溴氰菊酯正读数试纸条的制备。该试纸条在最佳缓冲液中对溴氰菊酯的可视检测限为6.25ng/mL，在小麦、大白菜和芹菜中为0.5μg/mL，且检测时间仅需8min。因此，本发明为溴氰菊酯检测提供了一种高灵敏度的多肽试剂，并建立了非竞争免疫层析方法实现了农产品中溴氰菊酯残留的快速、灵敏、低成本地检测，可作为一种可靠的溴氰菊酯初筛和现场检测工具。

技术研发人员：华修德,崔盼盼,丁园,马瑾煜,尤天阳
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/29