一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法

本发明涉及细胞生物学，尤其涉及一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，占所有胶质瘤的50％以上，目前胶质母细胞瘤(gbm)几乎没有有效的治疗方法，主要采用的是手术切除辅以术后放疗化疗以延长患者的生存时间，并且在手术后极易复发；

2、微管蛋白折叠辅助因子b(tbcb)，是辅因子家族(tbca-tbce)之一，是微管蛋白α-t重头合成过程中的重要因子，tbcb通过将微管蛋白单体引导至异二聚化途径来稳定α-微管蛋白，通过与α-t绑定，帮助其折叠，使之具备与β-tubulin(β-t)形成二聚体的能力，从而参与并调节微管的组装、生长及动态稳定，在微管生物合成中发挥重要作用；

3、最新研究表明在乳腺癌组织中tbcb的表达水平显著上调，tbcb的过度表达可能会增加乳腺癌细胞的恶性程度。另外，过度表达的tbcb可解聚人宫颈腺癌(hela)细胞中的微管。首次证明可以通过tbcb抑制微管聚合，促进细胞增殖，迁移和入侵。并且干扰tbcb的表达后肿瘤细胞的增值、迁移和侵袭能力下降，证实tbcb与肿瘤发生和肿瘤转移密切相关。因此可以从tbcb角度入手，发明出对胶质母细胞瘤的迁移增殖机制进行准确研究的方法，让人们更好的了解影响胶质母细胞瘤迁移增殖的因素，从而能够根据研究结果制定更好的肿瘤治疗策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，包括如下步骤：

4、s1：细胞组织样本培养；

5、s2：转染细胞；

6、s3：蛋白样品的变性制备；

7、s4：蛋白质印迹；

8、s5：荧光定量pcr；

9、s6：免疫荧光；

10、s7：数据分析。

11、优选的：所述s1中，细胞组织样本在补充有10％fbs和1％青霉素-链霉素的高糖dmem中，在37℃和5％co2条件下培养。

12、进一步的：所述s2中，将细胞样本接种到6/24孔板，分为两组：阴性对照组与tbcb沉默组，将sirna寡核苷酸导入两个分组中的细胞样本内，两组均为6小时后更换含10％fbs的高糖dmem，转染48h后收集细胞进行qrt-pcr分析，转染72h后收集细胞，用对应抗体进行western blotting和if染色分析。

13、进一步优选的：所述s3中，将在六孔板上培养的两组细胞用4℃0.01mol/l的pbs缓冲液洗涤2-3次，随后吸干pbs缓冲液，然后将对应六孔板放置在冰上，根据细胞密度用适量的细胞裂解液在冰上裂解细胞，并用细胞刮刀研磨细胞使其从孔板底部脱落并在裂解液中充分裂解，刮取研磨充分后，将带有细胞的裂解液从孔板吸出，于冰上裂解三十分钟后，置于低温超速离心机中，在4℃、12000rpm条件下，离心三十分钟；

14、离心后吸取上清液到另一管，并取2ul上清液进行蛋白质浓度测定；用裂解液配平蛋白浓度后，加入1/4上清液的蛋白上样缓冲液，放入100℃金属浴中煮蛋白5min使其变性。

15、作为本发明一种优选的：所述s4中，蛋白质印迹包括如下步骤：

16、a1：制胶；

17、a2：蛋白上样与电泳；

18、a3：电转；

19、a4：封闭；

20、a5：孵一抗；

21、a6：孵二抗；

22、a7：成像。

23、作为本发明进一步优选的：所述s5中，荧光定量pcr包括如下步骤：

24、b1：提取rna；

25、b2：rna逆转录；

26、b3：荧光定量pcr反应。

27、作为本发明再进一步的方案：所述s6中，一抗孵育结束后，用pbst洗涤3次后，加入二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤3次，每次检测十分钟，用含dapi的抗淬灭封片剂进行封片，待封片剂凝固后，在荧光显微镜下观察和拍摄。

28、在前述方案的基础上：所述s7中，每组实验重复三次，所有数据均使用graphpadprism 9.0软件进行统计分析，以平均值±标准差表示。

29、本发明的有益效果为：

30、1.通过本研究方法能够研究得出tbcb与胶质母细胞瘤(gbm)的迁移增值密切相关，下调tbcb会抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，tbcb可通过与eb1和eb3结合来调节mt+末端的生长，其可受到erk信号通路的调节，tbcb通过调节mt阳性末端来影响胶质瘤突起的生长，并进一步影响胶质瘤迁移，从而为胶质母细胞瘤的治疗研究提供新的方向，能够让人们更好的了解影响胶质母细胞瘤迁移增殖的因素，从而根据研究结果制定更好的肿瘤治疗策略。

技术特征：

1.一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s1中，细胞组织样本在补充有10％fbs和1％青霉素-链霉素的高糖dmem中，在37℃和5％co2条件下培养。

3.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s2中，将细胞样本接种到6/24孔板，分为两组：阴性对照组与tbcb沉默组，将sirna寡核苷酸导入两个分组中的细胞样本内，两组均为6小时后更换含10％fbs的高糖dmem，转染48h后收集细胞进行qrt-pcr分析，转染72h后收集细胞，用对应抗体进行western blotting和if染色分析。

4.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s3中，将在六孔板上培养的两组细胞用4℃0.01mol/l的pbs缓冲液洗涤2-3次，随后吸干pbs缓冲液，然后将对应六孔板放置在冰上，根据细胞密度用适量的细胞裂解液在冰上裂解细胞，并用细胞刮刀研磨细胞使其从孔板底部脱落并在裂解液中充分裂解，刮取研磨充分后，将带有细胞的裂解液从孔板吸出，于冰上裂解三十分钟后，置于低温超速离心机中，在4℃、12000rpm条件下，离心三十分钟；

5.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s4中，蛋白质印迹包括如下步骤：

6.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s5中，荧光定量pcr包括如下步骤：

7.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s6中，一抗孵育结束后，用pbst洗涤3次后，加入二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤3次，每次检测十分钟，用含dapi的抗淬灭封片剂进行封片，待封片剂凝固后，在荧光显微镜下观察和拍摄。

8.根据权利要求1所述的一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，其特征在于，所述s7中，每组实验重复三次，所有数据均使用graphpad prism 9.0软件进行统计分析，以平均值±标准差表示。

技术总结
本发明公开了一种胶质母细胞瘤迁移增殖机制的研究方法，涉及细胞生物学技术领域；为了更好的了解影响胶质母细胞瘤迁移增殖的因素，根据研究结果制定更好的肿瘤治疗策略；具体包括如下步骤：细胞组织样本培养；转染细胞；蛋白样品的变性制备；蛋白质印迹；荧光定量PCR；免疫荧光；数据分析；细胞组织样本在补充有10％FBS和1％青霉素‑链霉素的高糖DMEM中。本发明研究得出TBCB与胶质母细胞瘤的迁移增值密切相关，TBCB通过调节MT阳性末端来影响胶质瘤突起的生长，影响胶质瘤迁移，为胶质母细胞瘤的治疗研究提供新的方向，让人们更好的了解影响胶质母细胞瘤迁移增殖的因素，根据研究结果制定更好的肿瘤治疗策略。

技术研发人员：张邴秋,刘辉,史磊,王强
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/15