一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒及其检测方法

本发明涉及微生物检测，且特别涉及一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae,kp)属于肠杆菌目，是一种常见的条件致病菌和医院感染菌。根据毒力和致病特点可将kp分为“经典”肺炎克雷伯菌（classicalkiebsiella preu-moniae,ckp）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent kiebsiellapneremtonia,hvkp)。ckp是常见的院内感染菌，其携带的毒力基因较少，致病力较弱，但对抗菌药物可以表现为高水平的多重耐药。1986年hvkp在中国台湾首次被发现，研究者很快发现，这种kp具有高侵袭性，能向远处转移，常见的菌转移部位包括眼、肺、肝、全身软组织和中枢神经系统，临床上称之为侵袭综合征，常表达为预后差、病死率高，有较重的后遗症。hvkp为社区获得性感染菌，越来越多地引起医院感染。此外，过去hvkp除了对氨苄西林天然耐药外对其他抗菌药物非常敏感，但随着抗生素不合理使用，编码耐药基因和毒力基因的质粒或整合性接合元件(integrative and conjugative elements，ices)在不同谱系kp之间水平传播，使得hvkp出现了多种耐药表型，特别是高毒力肺炎克雷伯菌获取耐碳青霉烯类基因成为高毒力耐碳青霉烯类肺炎克雷伯(cr-hvkp)，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。

2、目前临床上发现的 cr-hvkp 来源主要有两种：1、hvkp 获得染色体或质粒编码的耐药基因；2、crkp可获得毒力基因甚至毒力质粒。因此深度探索耐药基因及毒力基因在肺炎克雷伯菌中转移及调控机制为最终控制 cr-hvkp 菌株的播散至关重要。值得注意的是，在所有全基因组测序的hvkp克隆谱系中都检测到一个大的毒力质粒(plvpk，一个pk2044样质粒)，该质粒编码需氧肌动蛋白、盐胆素和rmpa/rmpa2，这些仅在hvkp中发现。研究发现，缺乏plvpk的cc23菌株显其毒力著降低，表明该质粒在肺炎克雷伯菌的高毒力中发挥了重要作用。同时肺炎克雷伯菌的荚膜（capsule，cps）覆盖在细菌的表面起保护作用，因此是kp重要的毒力因子。cps合成受多种调控基因调控，其中hvkp毒力质粒plvpk的rmpa/rmpa2调控基因能够促进荚膜合成，在增强kp的毒力起到很重要的作用。

3、目前，对于高毒力肺炎克雷伯菌检测主要通过pcr技术或基因测序技术检测毒力基因来确认。pcr虽然具有较高灵敏度和特异性，但临床应用需要专业的技术人员操作和临床基因扩增实验室，准入要求高。另外，该方法操作步骤多，流程相对繁琐，且难以实现现场的及时监测。基因测序方法除了pcr技术的局限外其检测费用昂贵，所以无法用于实际常规的检测和临床应用。因此，提供一种简单快捷、经济实惠、灵敏特异的高毒力肺炎克雷伯菌检测试剂盒，来提高安全预测预警水准和预防感染事件的发生十分迫切。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、检测快速且成本低。

2、本发明的另一目的在于提供一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒的检测方法，该方法操作简单、快捷，且可实现现场及时监测。

3、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

4、本发明提出一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，包括红黄显色法反应预混液和rmpa2基因扩增引物，所述红黄显色法反应预混液包括bstl dna聚合酶、反应缓冲液、无菌水和耐热型反转录酶，所述反应缓冲液包括mg2+、dntp和红黄显色染料。

5、本发明提出一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

6、s1、提取样本dna/rna；

7、s2、将所述红黄显色法反应预混液和所述rmpa2基因扩增引物混合后，加入所述样本dna/rna进行核酸扩增反应；

8、s3、对所述核酸扩增反应的结果进行判读，若反应液为明黄色，则说明存在高毒力肺炎克雷伯菌，若反应液为橙红色或红色，则说明不存在高毒力肺炎克雷伯菌。

9、本发明实施例的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒及其检测方法的有益效果是：

10、本发明的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒包括红黄显色法反应预混液和扩增引物。使用时只需要将红黄显色法反应预混液和扩增引物混合并加入dna/rna模板，在恒温条件孵育30~45min，即可完成微量拷贝的核酸扩增反应。本产品为红黄变色反应，在扩增完成后，阳性结果为明黄色，阴性结果为橙红色或红色，通过肉眼观察即可对反应结果进行判读。该试剂盒灵敏度高且成本低，其操作简单、检测快速，还可实现现场及时监测，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1. 一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，其特征在于，包括红黄显色法反应预混液和rmpa2基因扩增引物，所述红黄显色法反应预混液包括bstl dna聚合酶、反应缓冲液、无菌水和耐热型反转录酶，所述反应缓冲液包括mg2+、dntp和红黄显色染料。

2. 根据权利要求1所述的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述rmpa2基因扩增引物包括上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip，所述上游外引物f3的序列如seq id no：1所示，所述下游外引物b3的序列如seq id no：2所示，所述上游内引物fip的序列如seq id no：3所示，所述下游内引物bip的序列如seq idno：4所示。

3.根据权利要求2所述的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒的反应体系配置为：

4. 根据权利要求3所述的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述红黄显色法反应预混液 44μl配置为：

5. 根据权利要求3所述的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述rmpa2_1 10×primer mix5μl配置为：

6.一种如权利要求1~5任意一项所述的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述核酸扩增反应的温度为62~68℃，反应时间为30~45min。

技术总结
本发明提供一种高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括红黄显色法反应预混液和rmpA2基因扩增引物。红黄显色法反应预混液包括BstL DNA聚合酶、反应缓冲液、无菌水和耐热型反转录酶。反应缓冲液包括Mg<supgt;2+</supgt;、dNTP和红黄显色染料。本发明的高毒力肺炎克雷伯菌快速检测试剂盒使用时只需要将红黄显色法反应预混液和扩增引物混合并加入DNA/RNA模板，在恒温条件孵育30~45min，即可完成微量拷贝的核酸扩增反应。本产品为红黄变色反应，在扩增完成后，阳性结果为明黄色，阴性结果为橙红色或红色，通过肉眼观察即可对反应结果进行判读。该试剂盒灵敏度高且成本低，其操作简单、检测快速，还可实现现场及时监测，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：涂海健,邱德辉,陈展飞
受保护的技术使用者：莆田学院
技术研发日：
技术公布日：2024/8/16