高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法

本发明涉及合成生物学与分子生物学领域，具体涉及一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法。

背景技术：

1、放线菌基因组蕴含强大的天然产物合成潜力，一直是新药开发的重要来源。放线菌在次级代谢过程中可产生丰富的抗生素、抗癌药物等天然产物。不过放线菌基因组中大多数次级代谢天然产物的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster，bgc)在常规实验条件下表达水平较低甚至不表达，阻碍了相关天然产物的开发。原位激活或异源表达是挖掘放线菌天然产物的有效方式，而启动子作为基因表达的“开关”，在其中发挥着至关重要的作用。基于合成生物学基因编辑技术，利用高效的启动子替换低表达或沉默基因簇上游的天然启动子可以有效的避免胞内原本复杂的代谢调控网络，有利于增强目标生物合成途径的效率，提高或激活目标化合物的合成。

2、具有良好特性的启动子是合成生物学和代谢工程的重要元件，对放线菌生物合成途径优化或者全新生物活性物质的发现至关重要。目前链霉菌常用的天然启动子有红霉素抗性基因启动子ermep*、由链霉菌噬菌体中筛选得到的sf14p、来源于天蓝色链霉菌的kasop*和来源于变铅青链霉菌的tipap等。然而当前链霉菌中性能优良的启动子仍非常有限，亟待进一步开发以满足科研及生产中的不同需求。与此同时，为了能高效的鉴定性能优良的启动子，开发方便可用的高通量筛选方法也必不可少。

3、刺糖多孢菌是一种稀有放线菌，可以发酵产生一种绿色生物农药多杀菌素，具有重要的工业价值。但面临着发酵产量低、成本高等难题，限制了多杀菌素这一绿色生物农药的大规模推广应用。多杀菌素生物合成途径已经得到解析，但其在胞内合成的调控机制尚不清晰，多杀菌素合成基因簇整体的表达水平偏低是造成其发酵产量低的直接原因。不过由于缺乏适用于该菌的性能优良的启动子元件，针对基因簇高表达的代谢工程改造受到限制。当前在刺糖多孢菌中适用的启动子元件较为匮乏，也没有成熟的报告系统的研究报道，异源启动子在该菌内的兼容性未知。难以对靶基因的表达量进行精确调控，不利于目标产物合成途径的优化。为给该菌的代谢工程改造提供必要的元件，挖掘该菌内源性能优异的启动子十分必要。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明基于刺糖多孢菌转录组数据分析挑选了一系列表达强弱不同的启动子，并通过荧光报告系统进行精确表征，筛选、鉴定出适合于过表达多杀菌素生物合成途径中关键的糖基转移酶编码基因spnp强表达的启动子，为代谢途径优化提供了备选元件库和有益的参考。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，包含有过表达spnp质粒，所述过表达spnp质粒以启动子p15作为spnp基因表达的启动子，启动子p15的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、作为优选，所述启动子p15是通过荧光蛋白mcherry的报告系统进行筛选鉴定而获得。

5、作为优选，所述过表达spnp质粒的构建方法，包括如下步骤：

6、s1.以刺糖多孢菌基因组为模板，扩增得到spnp片段；

7、s2.将spnp片段连接到质粒载体上；

8、s3.以刺糖多孢菌基因组为模板，扩增得到启动子p15；

9、s4.将启动子p15连接到步骤s2中连接有spnp片段的质粒载体上，得到所述过表达spnp质粒。

10、作为优选，步骤s3中，扩增启动子p15所使用的扩增引物为p15-f和p15-r，p15-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，p15-r的核苷酸序列如seq id no.3所示。

11、作为优选，所述质粒载体采用载体pcm275，载体pcm275的核苷酸序列如seq idno.5所示。

12、作为优选，步骤s4中，使用kpni、ndei进行双酶切，将启动子p15连接到步骤s2中连接有spnp片段的质粒载体上。

13、作为优选，以刺糖多孢菌nrrl 18395菌株为出发菌株。

14、作为优选，所述刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量为出发菌株刺糖多孢菌nrrl18395的1.5-2倍。

15、本发明的第二方面，提供一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素产量的方法，以启动子p15作为刺糖多孢菌的spnp基因表达的启动子，启动子p15的核苷酸序列如seq id no.1所示。

16、本发明具有如下优点：

17、1、本发明基于转录组数据分析，挑选了一系列表达强弱不同的刺糖多孢菌内源启动子作为候选，筛选、鉴定出适合于过表达多杀菌素生物合成途径中关键的糖基转移酶编码基因spnp强表达的启动子，为该菌的代谢工程改造提供了丰富的元件。

18、2、本发明利用筛选获得的高表达启动子p15，驱动spnp基因的过表达，显著提高了多杀菌素发酵产量。

技术特征：

1.一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，包含有过表达spnp质粒，其特征在于，所述过表达spnp质粒以启动子p15作为spnp基因表达的启动子，启动子p15的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，所述启动子p15是通过荧光蛋白mcherry的报告系统进行筛选鉴定而获得。

3.根据权利要求1所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，所述过表达spnp质粒的构建方法，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，步骤s3中，扩增启动子p15所使用的扩增引物为p15-f和p15-r，p15-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，p15-r的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5.根据权利要求3所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，所述质粒载体采用载体pcm275，载体pcm275的核苷酸序列如seq id no.5所示。

6.根据权利要求5所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，步骤s4中，使用kpni、ndei进行双酶切，将启动子p15连接到步骤s2中连接有spnp片段的质粒载体上。

7.根据权利要求3所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，以刺糖多孢菌nrrl 18395菌株为出发菌株。

8.根据权利要求1所述的一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于，所述刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量为出发菌株刺糖多孢菌nrrl 18395的1.5-2倍。

9.一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素产量的方法，其特征在于，以启动子p15作为刺糖多孢菌的spnp基因表达的启动子，启动子p15的核苷酸序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明涉及合成生物学与分子生物学领域，公开一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法，该刺糖多孢菌包含有过表达spnP质粒，所述过表达spnP质粒以启动子P15作为spnP基因表达的启动子，启动子P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用筛选获得的高表达启动子P15，驱动spnP基因的过表达，显著提高了多杀菌素发酵产量。

技术研发人员：王文方,芦银华,刘合伟,陈少欣
受保护的技术使用者：上海师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/8/27