用于油田含油固废无害化处理的菌株LJD-20及其菌剂制备和应用

本发明涉及微生物，具体涉及用于油田含油固废无害化处理的菌株ljd-20及其菌剂制备和应用。

背景技术：

1、多环芳烃及石油烃是一类环境污染物，普遍存在于土壤和水体当中，能够对生态环境和人类健康构成重大危害。在常见的pahs及其衍生物中，菲常被作为模式化合物用于pahs生物降解研究。主要原因是由于其独特的化学结构，以及其具有持久性、致癌、致畸、致突变性及生物累积性等特性。

2、土壤中pahs及石油烃的修复方法有很多，相对于传统的物理、化学等修复手段来说，生物修复技术因其具有成本低、效果好、无二次污染等优点，已成为被广泛认可的具有绿色、可持续、潜力大等优势的修复技术。目前，已报道的pahs及石油烃降解真菌菌株较少，主要包括trichoderma，fusarium和aspergillus等。依赖纯培养方法能够确定降解菌种类、功能基因及代谢特征提供了线索。然而，由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多真菌尤其是具有特定功能的真菌都不能通过纯培养的方式分离获得；同时，纯培养方法大大低估了原核微生物多样性，不能解释在自然环境中微生物群落内个体之间复杂的相互作用，同时也不能反映污染环境中功能微生物对污染物降解的真实情况。并且，分离得到的功能微生物能否在自然生境中发挥作用仍然是值得怀疑的。因此，很难利用实验室培养来揭示原位土著真菌的生态功能。

3、利用不可培养法可以不需要通过实验室培养来评估功能微生物的代谢反应，并直接将它们的特性与自然生境中的功能联系起来。稳定同位素探针(sip)技术能够将稳定同位素标记技术和分子生物学手段如高通量测序、trflp等相结合，通过向环境样品中加入稳定性同位素标记的目标化合物(13c或15n)，运用分子生物学手段对被稳定性同位素标记的生物标志物(如dna、rna等)进行分析，可以确定环境样品中的具有降解功能的真菌微生物。该技术可以跳过分离培养这一要求，直接将微生物群落和功能相联系。目前，应用sip技术已经成功鉴定出多种pahs降解功能真菌，但未有研究人员通过分离培养方式成功地将其分离出来，因此我们无法对该类菌株进行实际修复应用。因此，本研究以菲为目标化合物，利用sip探查出pahs及石油烃降解真菌微生物，根据鉴定出的功能真菌的亲缘关系等消息，设置选择性培养基，筛选出具有原位降解功能的真菌，以期为pahs及石油烃的生物处理提供数据支持。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供紫萝海杆菌(penicillium roseopurpureum)ljd-20，保藏编号为gdmcc no：62387。

2、紫萝海杆菌(penicillium roseopurpureum)ljd-20，是在2022年在东营石油污染场地含油固废中分离并鉴定的紫萝海杆，但关于该菌株对pahs和石油烃降解研究国内外还未见报道。本研究采用sip-纯培养技术从山东省东营市胜利油田含油固废中探查、驯化和分离得到1株以菲和原油作为碳源的高效菌株，对其进行鉴定，研究其生长特性及其对菲和原油的降解特性，同时将其制备成微生物菌剂并探究其对污染物的降解特性，为pahs和原油污染环境的生物修复提供参考。

3、本发明的第二个目的是提供一种菲降解菌剂，其包含上述的紫萝海杆菌ljd-20作为活性成分。

4、优选地，所述的菲降解菌剂的制备方法为：

5、1)将玉米与水按质量比1:5比例加热制成糊状，再将其与木屑、麦麸和木质素磺酸钠以150:100:10:1的质量比例混合，挼搓成团后，放入搓丸机中，以制得球状培养基质，灭菌烘干备用；

6、2)将紫萝海杆菌ljd-20制成菌丝含量10g/l的菌液；

7、3)将菌液按质量比1:10的比例加至质量体积分数3％的海藻酸钠溶液中，并与步骤1)的球状培养基质充分混合后，加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理，得到丸状的包封真菌；

8、4)将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后，即为紫萝海杆菌ljd-20菌剂。

9、本发明的第三个目的是提供上述的紫萝海杆菌ljd-20或上述的菌剂在降解菲或石油烃中的应用。

10、优选地，所述的降解菲或石油烃是降解石油污染土壤中的菲或石油烃。

11、优选地，是将紫萝海杆菌ljd-20应用在菲或石油烃污染的环境中对菲或石油烃进行降解。

12、本发明的第四个目的是提供上述的紫萝海杆菌ljd-20或上述的菌剂在油田含油固废无害化处理中的应用。

13、本发明的第五个目的是提供上述的紫萝海杆菌ljd-20或上述的菌剂在菲或石油烃污染环境的生物修复中的应用。

14、优选地，所述的菲或石油烃污染环境包括菲或石油烃污染的水体和/或土壤。

15、本发明的第五个目的是提供一种降解菲或石油烃的方法，其包括使用上述的紫萝海杆菌ljd-20或上述的菌剂处理含有菲或石油烃的环境，对菲或石油烃进行降解。

16、本发明的优点：

17、本发明采用dna稳定同位素探针(sip)技术探究到了胜利油田含油固废中的多环芳烃降解功能微生物为otu_71所代表的真菌，它属于青霉菌，与紫萝海杆菌(penicilliumroseopurpureum)的its相似性最高(97.4％)。我们从鉴定的功能菌亲缘关系出发，选用选择性培养基，成功从由胜利油田油田含油固废中定向驯化和分离得到一株以菲和原油为碳源的降解菌株ljd-20，根据菌株形态、生理特征、its基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为penicillium roseopurpureum。由于ljd-20和otu_71的相似性为100％，确证了该菌株为原位菲降功能微生物所代表的典型菌株。ljd-20生长的最佳环境条件为：温度为33℃，ph值为6；its基因测序分析结果显示与ljd-20最相近的菌株为penicilliumroseopurpureum isolate p18(jn246023.1)。penicillium roseopurpureum ljd-20能够利用菲和原油作为唯一碳源并且很快地降解菲和原油；菲和原油萘初始质量浓度为100mg·l-1和500mg·l-1培养7天后，降解率分别为74.3和71.2％；将该菌制备成菌剂后其降解率可分别达到83.4％和81.6％。因此，该菌株在石油污染土壤生物修复方面具有较好的应用潜力。

18、紫萝海杆菌(penicillium roseopurpureum)ljd-20，其于2022年4月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：62387。

技术特征：

1.紫萝海杆菌(penicillium roseopurpureum)ljd-20，保藏编号为gdmcc no：62387。

2.一种菲降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的紫萝海杆菌ljd-20作为活性成分。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的菲降解菌剂的制备方法为：

4.权利要求1所述的紫萝海杆菌ljd-20或权利要求2所述的菌剂在降解菲或石油烃中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的降解菲或石油烃是降解石油污染土壤中的菲或石油烃。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是将紫萝海杆菌ljd-20应用在菲或石油烃污染的环境中对菲或石油烃进行降解。

7.权利要求1所述的紫萝海杆菌ljd-20或权利要求2所述的菌剂在油田含油固废无害化处理中的应用。

8.权利要求1所述的紫萝海杆菌ljd-20或权利要求2所述的菌剂在菲或石油烃污染环境的生物修复中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的菲或石油烃污染环境包括菲或石油烃污染的水体和/或土壤。

10.一种降解菲或石油烃的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的紫萝海杆菌ljd-20或权利要求2所述的菌剂处理含有菲或石油烃的环境，对菲或石油烃进行降解。

技术总结
本发明公开了用于油田含油固废无害化处理的菌株LJD‑20及其菌剂制备和应用。紫萝海杆菌(Penicillium roseopurpureum)LJD‑20，保藏编号为GDMCC No：62387。该菌株能够利用菲和原油作为唯一碳源并且很快地降解菲和原油；菲和原油萘初始质量浓度为100mg·L<supgt;‑1</supgt;和500mg·L<supgt;‑1</supgt;培养7天后，降解率分别为74.3和71.2％；将该菌制备成菌剂后其降解率可分别达到83.4％和81.6％。因此，该菌株在石油污染土壤生物修复方面具有较好的应用潜力。

技术研发人员：李继兵,罗春玲,江龙飞,张干
受保护的技术使用者：中国科学院广州地球化学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/19