一种荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于生物分析与检测，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、非经典核酸二级结构i-motif，是在特定条件下由富含胞嘧啶的dna序列形成的四链体结构；i-motif的存在和稳定性依赖于酸性ph条件、分子拥挤程度和其特定的核苷酸序列。尽管i-motif结构在自然条件下的稳定性较低，但其在基因调控、染色体稳定性以及细胞老化等生物过程中的潜在作用引起了科研界的广泛关注。

2、自i-motif结构首次发现至今，其在端粒和癌基因启动子等关键dna区域的功能研究持续深化；这些结构可通过与特定小分子或蛋白相互作用，直接调控基因的转录活性，影响癌基因表达。i-motif还可作为基因治疗载体，将治疗基因送达至病变部位；同时，其独特结构及识别特性也使其成为生物传感器和药物靶标的理想候选。通过设计高特异性探针，基于i-motif的生物传感器能精准监测dna结构变化。此外，这种探针的结合特性也支持i-motif作为药物靶标的开发，促进高靶向性药物载体的开发，有效送达药物至病变部位，提高疗效并减少副作用。

3、i-motif结构在活细胞中的识别和追踪面临技术挑战，导致对其细胞内分布和功能的研究受限，现有荧光标记等探针技术虽能发现i-motif，但多数探针的选择性和敏感度未达到高精度生物医学研究要求。目前，可识别i-motif结构的方法主要包括蛋白抗体和小分子探针，但报导的探针数量不超过十种，主要分为两大类：一类是可从单链dna中识别i-motif的探针，如结晶紫和噻唑橙，这些探针在细胞层面的特异性结合能力有限；另一类探针可从富含鸟嘌呤的g-四链体中识别i-motif，i-motif与g-四链体(g4)结构相似，但g4在生理条件下更稳定，成为研究中的干扰因素。目前可有效识别i-motif的探针包括8e和中性红等，但这些配体在细胞层面的活性具有一定缺陷。

4、为了克服这些问题，开发新型的、高特异性的i-motif探针成为了研究领域的一大需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针具有高特异性和灵敏性，可实现对i-motif结构的识别与检测。

2、为达到上述目的所采取的技术方案是，提供一种荧光探针，荧光探针具有如式i所示结构：

3、

4、本发明采用上述技术方案的有益效果为：本发明的具有如式i所示结构的荧光探针相较于中性红，其区分端粒dna的i-motif结构和g-四链体结构的能力更强；本发明的荧光探针具有高特异性，其对不同dna结构具有区分能力，特别是对hteloc序列(富含胞嘧啶的i-motif形成序列)显示出较强的荧光信号，说明本发明的荧光探针对i-motif结构具有显著的选择性；同时，本发明的荧光探针还具有良好的灵敏度，随着dna与荧光探针比例的增加，hteloc的荧光信号相对于背景显著增强，表明本发明的荧光探针能灵敏地检测到i-motif结构的形成，并且这种检测是量化的。

5、本发明还提供一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)酸性条件下，将中性红和化合物a混合并在催化剂的作用下反应制得中间化合物1；

7、(2)将中间化合物1和化合物b溶于有机溶剂中反应制得式i所示荧光探针；其合成路线如下：

8、

9、优选的，步骤(1)包括以下步骤：将中性红溶于浓盐酸中，再加入到催化剂的水溶液中，静置后加入化合物a进行反应，制得中间化合物1。

10、更优选的，静置温度为0～3℃，时间为1～1.5h。

11、更优选的，静置温度为0℃，时间为1h。

12、优选的，催化剂为亚硝酸钠；有机溶剂为甲醇与n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液；r1为铜元素；r2为钠元素。

13、优选的，步骤(1)的反应温度为0～25℃，反应时间为13～17h；步骤(2)的反应温度为75～85℃，反应时间为70～74h。

14、更优选的，步骤(2)的反应温度为80℃，反应时间为72h。

15、本发明还提供上述荧光探针在i-motif结构检测或在制备i-motif结构检测试剂盒中的应用。

16、优选的，i-motif结构来源于人体端粒序列c、人体端粒序列c的突变序列或能形成dna二级结构的序列。

17、优选的，人体端粒序列c的核苷酸序列如seq id no.1所示。

18、优选的，荧光探针在i-motif结构检测中的应用，包括以下步骤：

19、将荧光探针溶于有机溶剂中配制成检测液，将检测液、缓冲溶液与所需检测的dna溶液混合孵育，再在波长570～750nm下检测荧光信号，即可检测出dna中的人体端粒序列c、人体端粒序列c的突变序列或能形成dna二级结构的序列中的i-motif结构。

20、优选的，混合孵育温度为24～26℃，时间为3.5～4.5h。

21、更优选的，混合孵育温度为25℃，时间为4h。

22、更优选的，所述有机溶剂为甲醇。

23、本发明还提供一种i-motif结构检测试剂盒，包括如式i所示结构的荧光探针。

24、更优选的，i-motif结构检测试剂盒还包括有机溶剂及缓冲溶液。

25、本发明具有以下有益效果：

26、(1)本发明的荧光探针对端粒dna的i-motif结构和g-四链体结构的区分能力较强；本发明的荧光探针具有高特异性及高灵敏度，对不同dna结构具有区分能力，特别是对hteloc序列显示出较强的荧光信号，并对i-motif结构具有显著的选择性及检测灵敏强度。

27、(2)本发明的荧光探针的制备方法简单，原料易得，可满足i-motif结构检测与量化的实际需求。

技术特征：

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如式i所示结构：

2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述催化剂为亚硝酸钠；所述有机溶剂为甲醇与n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液；所述r1为铜元素；所述r2为钠元素。

4.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的反应温度为0～25℃，反应时间为13～17h；所述步骤(2)的反应温度为75～85℃，反应时间为70～74h。

5.权利要求1所述的荧光探针在i-motif结构检测或在制备i-motif结构检测试剂盒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述i-motif结构来源于人体端粒序列c、人体端粒序列c的突变序列或能形成dna二级结构的序列。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述混合孵育温度为24～26℃，时间为3.5～4.5h。

9.一种i-motif结构检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光探针。

10.如权利要求9所述的i-motif结构检测试剂盒，其特征在于，还包括有机溶剂及缓冲溶液。

技术总结
本发明提供一种荧光探针及其制备方法和应用，属于生物分析与检测技术领域。本发明的荧光探针具有如式I所示的结构；本发明还提供该荧光探针的制备方法及其在i‑motif结构检测或在制备i‑motif结构检测试剂盒中的应用。本发明的荧光探针对端粒DNA的i‑motif结构检测效果好，并对i‑motif结构和G‑四链体结构区分能力强，且具有高特异性及高灵敏度，可满足i‑motif结构检测与量化的实际需求。

技术研发人员：杨千帆,王延熙,石润雨
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/2