一种烟草甲RNAi干扰片段制备方法及其用途与流程

本发明涉及烟草加工，尤其涉及一种烟草甲rnai干扰片段制备方法及其用途。

背景技术：

1、烟草甲是一种体型微小的储粮害虫，以幼虫藏身于干燥的储粮中进行蛀食。烟草甲食性广泛，主要对谷物、药材、烟草、书籍等产生为害，其中对烟草行业造成的经济损失最为巨大。目前针对烟草甲的防治手段主要有物理防治、化学防治及生物防治，这些防治方法均有一定的作用，但应用上具有一定的局限性。化学防治应用最为广泛，目前，常使用磷化铝熏蒸来防治烟草甲，这种方法效果较明显，但因长时间使用，部分烟草甲种群已经对其具有抗性，杀虫效果明显下降，且熏蒸过程中产生的磷化氢气体有剧毒，对操作人员的安全存在潜在的威胁。

2、rna干扰(rnainterference，rnai)是一种高度保守的、dsrna诱导的、同源mrna高效特异性降解，使相应基因不能表达，从而引发基因转录后使水平基因沉默，阻止相应蛋白产物合成，靶标基因功能丧失的技术。因此rna干扰这种靶标性强、绿色、安全的技术在害虫防控领域具有较大的应用潜力。此外，海藻糖作为昆虫的血糖，在昆虫的生长发育过程中有着重要的作用，但海藻糖不存在于哺乳动物中，因此使用rna干扰将海藻糖合成酶基因作为靶标基因，对于昆虫的防治具有较强可用性。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种烟草甲rnai干扰片段制备方法及其用途，本发明通过干扰烟草甲海藻糖合成酶基因的部分序列，得到烟草甲rnai干扰片段，并探寻最佳使用浓度和使用时长，以达到对烟草甲的防治效果。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

3、一种烟草甲rnai干扰片段制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1，选取烟草甲海藻糖合成酶基因的部分序列，具体见序列1；

5、步骤2，设计pcr扩增引物的5’端，分别加上t7启动子序列，得到上游引物序列及下游引物序列，上游引物序列具体见序列2，下游引物序列具体见序列3；

6、步骤3，使用引物pcr扩增，获得dna片段，利用体外转录试剂盒合成dsrna，纯化、干燥；

7、步骤4，将干燥的dsrna用40ul无核酸酶水溶解rna沉淀，获得最终使用的rna干扰片段。

8、进一步方案为，得到的烟草甲rnai干扰片段于-80℃保存备用。

9、本发明另一方面还提供了上述的制备方法得到的烟草甲rnai干扰片段。

10、本发明又一方面还提供了上述的制备方法得到的烟草甲rnai干扰片段作为杀虫剂的用途。

11、进一步方案为，将最终制备得的rnai干扰片段产物解冻后，调整浓度为3000ng/ul，使用显微注射方式于烟草甲幼虫时期注入体内；或饲喂幼虫。

12、本发明的有益效果在于：

13、(1)采用本发明选取的基因片段，以及所设计的引物，制备的dsrna具有较高的浓度；电泳条带清晰，检测其浓度和纯度俱佳，通过本发明提供的注射浓度，对提纯的rnai干扰片段进行使用，干扰烟草甲海藻糖合成酶基因的效果显著，为安全、高效的生物防治提供了新的防治方法和靶标基因。

14、(2)海藻糖是一种典型应激代谢物，为昆虫在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下生存，起着重要作用。烟草甲体内海藻糖含量丰富，而海藻糖合成酶为海藻糖合成的限速酶，沉默海藻糖合成酶基因进而控制该虫，为创新农业害虫防治新方法提供了理论依据和试验支持。

15、(3)本发明选择海藻糖合成酶基因作为rna干扰靶标，破坏昆虫海藻糖合成通路，阻止海藻糖的转化合成等生理过程，可达到害虫防治的目的，为害虫分子调控技术体系提供了较好的研究先例。此外，海藻糖不存在于哺乳动物中，对人体不会产生不良影响，实现绿色防虫，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种烟草甲rnai干扰片段制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，得到的烟草甲rnai干扰片段于-80℃保存备用。

3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法得到的烟草甲rnai干扰片段。

4.如权利要求1-2任一项所述的制备方法得到的烟草甲rnai干扰片段作为杀虫剂的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，将最终制备得的rnai干扰片段产物解冻后，调整浓度为3000ng/ul，使用显微注射方式于烟草甲幼虫时期注入体内；或饲喂幼虫。

技术总结
本发明公开了一种烟草甲RNAi干扰片段制备方法及其用途，通过制备出RNAi干扰片段并进行使用，干扰烟草甲海藻糖合成酶基因的效果显著，为安全、高效的生物防治提供了新的防治方法和靶标基因。本发明选择海藻糖合成酶基因作为RNA干扰靶标，破坏昆虫海藻糖合成通路，阻止海藻糖的转化合成等生理过程，可达到害虫防治的目的。

技术研发人员：薛芳,时向东,陈姣文,李东亮,李静,丁松爽,宋光富,汤清波
受保护的技术使用者：四川中烟工业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/20