酮基还原酶突变体、编码基因、载体及应用的制作方法

本发明涉及酶改造，具体为酮基还原酶突变体、编码基因、载体及应用。

背景技术：

1、醋酸艾司利卡西平是一种新型抗癫痫药物，是s-利卡西平醋酸酯前药，作用机理是通过阻断动作电位的传导，以抑制脑神经元的反复异常放电，控制癫痫发作。该药长期给药耐受性好，疗效和安全性较高。

2、目前合成醋酸艾司利卡西平主要起始原料是奥卡西平，奥卡西平还原生成艾司利卡西平，后续酯化得到成品。

3、艾司利卡西平的制备方法分为化学法和生物法，化学法合成艾司利卡西平反应过程中副反应多，且需要用到大量有机溶剂和贵重的化学催化剂，成本高且效率低，难以工业化生产。

4、而生物法主要通过酶催化反应制备艾司利卡西平，相较于化学法，酶催化的反应具有高度专一、反应速度快、反应条件温和等优点。但是奥卡西平不易溶解，需用到有机溶剂，且现有的酮基还原酶有机溶剂耐受性差、活性低。因此，筛选改造获得有机溶剂耐受性好、催化活性高的突变体对艾司利卡西平的生产具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了酮基还原酶突变体、编码基因、载体及应用，所述酮基还原酶突变体应用于酶催化制备艾司利卡西平能够解决有机溶剂耐受性差、活性低的缺陷，推广了酶催化制备艾司利卡西平的工业应用。

2、有鉴于此，本发明的方案为：

3、本发明的第一个方面，提出氨基酸序列如seq id no：2所示的酮基还原酶突变体。

4、本发明的第二个方面，提出编码上述第一个方面所述酮基还原突变体的基因。

5、本发明的第三个方面，提出表达载体，该表达载体含有第二个方面所述的基因。

6、本发明的第四个方面，提出一种菌株，包含有第三个方面所述的表达载体。

7、进一步地，所述菌株为大肠杆菌。

8、本发明的第五个方面，提出酮基还原酶突变体的生产方法，步骤包括：以第四个方面所述菌株进行培养，收集培养物得到酮基还原酶突变体。

9、本发明的第六个方面，提出第一个方面所述酮基还原酶突变体在催化酮基还原反应中的应用。

10、进一步地，所述催化酮基还原反应以奥卡西平为底物，进行还原反应制备得到艾司利卡西平。

11、本发明的第七个方面，提出艾司利卡西平的制备方法，步骤包括：向奥卡西平溶液中加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、还原性辅酶、助溶剂及第一个方面所述的酮基还原酶突变体进行混合，反应得到艾司利卡西平；所述奥卡西平溶液包括异丙醇溶剂及缓冲溶液。

12、进一步地，所述奥卡西平的浓度为5-50g/l；例如5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l或50g/l，优选为10g/l。

13、进一步地，所述酮基还原酶与奥卡西平的质量比为1：(10-100)；优选为1：20。

14、进一步地，所述葡萄糖与所述奥卡西平的质量比为1：(1-2)；优选为1：1.5。

15、进一步地，所述葡萄糖脱氢酶与所述奥卡西平的质量比为1：(10-1000)；优选为1：100。

16、进一步地，所述还原性辅酶优选为还原型辅酶ⅱ，与所述奥卡西平的质量比为1：(10-1000)，优选为1：200。

17、进一步地，所述奥卡西平溶液中异丙醇的体积百分比为5-50％；优选为5-20％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％；更优选10％。

18、进一步地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，ph值为6.0-8.0；优选ph值为7.0。

19、进一步地，所述反应温度为20-40℃，反应时间18-24h；反应体系ph为6.0-8.0，优选ph值为7.0。

20、进一步地，所述助溶剂包括dmso、吐温60、吐温80和曲拉通x-100中的一种或多种；所述助溶剂体积用量与反应体系总体积之比为1：(10-100)，优选为1：20。

21、本发明第八个方面，还提供酮基还原酶突变体的活性检测方法，步骤包括：

22、s1.还原体系的构建：向奥卡西平溶液中加入缓冲溶液、nadph及酮基还原酶；酮基还原酶可以为野生型，或任意突变改造得到的酮基还原酶突变体，优选第一个方面的酮基还原酶突变体；

23、s2.酶活测定：根据不同浓度nadph构建在340nm处吸光值的标准曲线，根据公式测算酮基还原酶酶活，公式如下：

24、其中k为吸光值变化斜率，根据还原体系不同时间时在340nm处的吸光值构建曲线得到；a为标准曲线的斜率，n为酮基还原酶液稀释倍数，v0为还原反应体系的体积，v1为酮基还原酶液体积，c为酮基还原酶液配置浓度。

25、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

26、本发明所述酮基还原酶突变体催化活性高，有机溶剂耐受性强，应用于酶催化制备艾司利卡西平能够提高生产效率，推广了酶催化制备艾司利卡西平的工业应用。

技术特征：

1.氨基酸序列如seq id no：2所示的酮基还原酶突变体。

2.编码权利要求1所述酮基还原突变体的基因。

3.表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。

4.一种菌株，其特征在于，包含有权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

6.酮基还原酶突变体的生产方法，其特征在于，步骤包括：以权利要求4所述菌株进行培养，收集培养物得到酮基还原酶突变体。

7.权利要求1所述酮基还原酶突变体在催化酮基还原反应中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化酮基还原反应以奥卡西平为底物，进行还原反应制备得到艾司利卡西平。

9.艾司利卡西平的制备方法，其特征在于，步骤包括：向奥卡西平溶液中加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、还原性辅酶、助溶剂及权利要求1所述的酮基还原酶突变体进行混合，反应得到艾司利卡西平；所述奥卡西平溶液包括异丙醇溶剂及缓冲溶液。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述奥卡西平的浓度为5-50g/l；

11.权利要求1所述酮基还原酶突变体的活性检测方法，其特征在于，步骤包括：

技术总结
本发明公开了酮基还原酶突变体、编码基因、载体及应用，所述酮基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该突变体应用于酶催化制备艾司利卡西平能够解决有机溶剂耐受性差、活性低的缺陷，推广了酶催化制备艾司利卡西平的工业应用。

技术研发人员：何鑫,汪声晨,陈海林,熊天涵,许檬丹,刘明欣,赵静,刘林,左权
受保护的技术使用者：黄冈人福药业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/1