一种检测新城疫病毒的引物探针组合及其应用

本发明涉及病毒检测领域，特别是涉及一种检测新城疫病毒的引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、新城疫(nd)又被称为亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒(ndv)引起的急性高度接触性传染病。ndv病毒粒子具有囊膜，其芯髓为不分节段的单股负链rna。根据其f基因的序列差异，可将病毒分为9个基因型，基因i型为无毒株，基因ii型为弱毒或中等毒株，其余7个基因型为强毒株。目前，ndv在全国各个地区均有流行，对养禽业危害严重。因此，对于ndv的快速诊断，对保障养禽业的健康发展具有重要意义。

2、目前常用的检测方法包括pcr法、实时定量pcr(qpcr)以及病原体分离和鉴定等，这些方法结果准确且具有高度特异性。然而，由于养殖场等基层单位通常缺乏必要的检测设备，这些技术在这些地方的应用存在一定困难。重组酶介导的等温扩增法(raa)是由吕蓓等在重组酶聚合酶扩增技术(rpa)的基础上，自主开发的一种新型的等温扩增技术，其原理是在37℃-42℃温度下从细菌或真菌下提取的重组酶可以与引物dna进行紧密结合，使核酸呈指数级扩增，从而被及时检测到。raa检测速度快、检测时间短(15-30min)、不需要精密的仪器、在恒温下(37-42℃)就可以进行体外核酸快速扩增，近几年raa被广泛应用到畜禽疾病诊断上。而目前鲜有采用rt-raa检测ndv的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测新城疫病毒的引物探针组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该引物探针组合能够特异性的检测新城疫病毒，利用该引物探针组合构建的rt-raa方法具有灵敏度高、重复性好、易于操作以及高效快捷等优势，为新城疫病毒的快速检测奠定理论基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测新城疫病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括：

4、特异性上游引物，其核苷酸序列为如seq id no：1-3所示的任一条序列；

5、特异性下游引物，其核苷酸序列为如seq id no：4-6所示的任一条序列；

6、探针，其核苷酸序列为如seq id no：7所示的序列；

7、其中，seq id no：7所示序列第31位的t碱基由荧光基团修饰，第33位为核酸类似物，第34位的t碱基由淬灭基团修饰，3’末端连接封闭基团。

8、优选的是，所述引物探针组合包括如下(1)-(4)任意一组：

9、(1)如seq id no：1所示的特异性上游引物、seq id no：5所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针；

10、(2)如seq id no：2所示的特异性上游引物、seq id no：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针；

11、(3)如seq id no：3所示的特异性上游引物、seq id no：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针；

12、(4)如seq id no：3所示的特异性上游引物、seq id no：6所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针。

13、优选的是，所述引物探针组合包括如seq id no：2所示的特异性上游引物、seq idno：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针。

14、优选的是，所述荧光基团包括fam，所述淬灭基团包括bhq，所述核酸类似物包括四氢呋喃，所述封闭基团包括c3 spacer亚磷酰胺。

15、本发明还提供一种非诊断目的的新城疫病毒的rt-raa检测方法，包括利用所述的引物探针组合扩增待测样品的rna，根据扩增产物的荧光信号的有无判断是否含有所述新城疫病毒。

16、优选的是，所述扩增的反应体系包括：缓冲液25μl、特异性上游引物和特异性下游引物各2.1μl、探针0.6μl和乙酸镁5μl，ddh2o补充到总体积45μl。

17、优选的是，所述扩增的反应条件为：39℃反应30min。

18、优选的是，当扩增产物有荧光信号时，即判断为所述待测样品中含有所述新城疫病毒。

19、本发明还提供所述的引物探针组合在制备检测新城疫病毒的试剂盒中的应用。

20、本发明还提供一种检测新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物探针组合。

21、本发明公开了以下技术效果：

22、本发明依据ndv-f基因的保守区域设计了检测ndv的引物探针组合，并建立了rt-raa检测方法，该检测方法可以在39℃30min内检测完毕。该方法稳定性好，特异性强，灵敏度高。操作简单快捷，不需要进行反转录，为一步法检测方法，且不需要严格的操作环境以及专业的实验人员即可操作，适用于临床快速检测，可为ndv快速检测提供技术支持。

技术特征：

1.一种检测新城疫病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：

2.如权利要求1所述的检测新城疫病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括如下(1)-(4)任意一组：

3.如权利要求2所述的检测新城疫病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括如seq id no：2所示的特异性上游引物、seq id no：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针。

4.如权利要求1所述的检测新城疫病毒的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括fam，所述淬灭基团包括bhq，所述核酸类似物包括四氢呋喃，所述封闭基团包括c3spacer亚磷酰胺。

5.一种非诊断目的的新城疫病毒的rt-raa检测方法，其特征在于，包括利用权利要求1-4任一项所述的引物探针组合扩增待测样品的rna，根据扩增产物的荧光信号的有无判断是否含有所述新城疫病毒。

6.如权利要求5所述的rt-raa检测方法，其特征在于，所述扩增的反应体系包括：缓冲液25μl、特异性上游引物和特异性下游引物各2.1μl、探针0.6μl和乙酸镁5μl，ddh2o补充到总体积45μl。

7.如权利要求5所述的rt-raa检测方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为：39℃反应30min。

8.如权利要求5所述的rt-raa检测方法，其特征在于，当扩增产物有荧光信号时，即判断为所述待测样品中含有所述新城疫病毒。

9.如权利要求1-4任一项所述的引物探针组合在制备检测新城疫病毒的试剂盒中的应用。

10.一种检测新城疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。

技术总结
本发明公开了一种检测新城疫病毒的引物探针组合及其应用，属于病毒检测领域。该引物探针组合包括：特异性上游引物，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：1‑3所示的任一条序列；特异性下游引物，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：4‑6所示的任一条序列；探针，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：7所示的序列。该引物探针组合能够特异性的检测新城疫病毒，利用该引物探针组合构建的RT‑RAA方法具有灵敏度高、重复性好、易于操作以及高效快捷等优势，为新城疫病毒的快速检测奠定理论基础。

技术研发人员：贾青辉,陈光明,张志强,吴同垒,冯婉莹,张香斋,李佩国,李蕴玉
受保护的技术使用者：河北科技师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/8/20