一种靶向TROP2的鲨鱼单域抗体5D2

本发明属于抗体制备领域，特别涉及一种靶向trop2的鲨鱼单域抗体5d2。

背景技术：

1、传统抗体是由两条重链和两条轻链组成的具有 y形结构、能够识别和结合抗原的蛋白质。每条重链包含一个可变区(vh)和三个恒定区(ch1、ch2、 ch3), 每条轻链包含一个可变区(vl)和一个恒定区 (cl)。其中, vh和vl结构域共同发挥识别和结合抗原的作用。1993年, 科学家在羊驼等骆驼科物种体内发现了天然的缺失轻链, 仅由重链形成的抗体,后来在鲨鱼等软骨鱼纲动物中也发现了类似的轻链缺失型重链抗体(heavy chainantibodies)。由于缺失轻链, 这种抗体中具有抗原识别与结合作用的只有重链可变区。而且这种重链可变区在体外也能够进行单独的重组表达, 并发挥识别和结合抗原的作用,称为单域抗体或纳米抗体。软骨鱼类（护士鲨、斑纹须鲨和角鲨等）的重链抗体的单一可变域称为vnar （variable domain of immunoglobulin new antigen receptor，vnar）。单域抗体具有由较长 loop 柔性区域组成的抗原结合区, 能够紧密结合到传统抗体不易识别的抗原表位, 其分子质量仅有 13 kda 左右, 大约为传统抗体的十分之一, 且易于在大肠杆菌中大规模表达, 能够显著降低制备成本。同时, 相较于传统抗体及其衍生物(如fabs、scfvs), 单域抗体具有更好的溶解度和稳定性。基于以上特点, 单域抗体被广泛应用于疾病诊疗、生化检测等领域。

2、trop2的全称为人滋养细胞表面糖蛋白抗原2，又名肿瘤相关钙信号传感器2，属于tacstd家族，是三阴性乳腺癌（tnbc）治疗的靶分子，在tnbc组织和肿瘤细胞中高表达。此外，trop2可以通过上调emt标志物来促进tnbc细胞的迁移和侵袭。trop2 在正常组织中表达有限，但在各种实体瘤中过度表达。trop2的结构中有多个磷酸化修饰位点和糖基化修饰位点，因此在细胞中发挥着多种功能，如细胞间的信号传递、钙信号的传导、调控靶蛋白的表达等。trop2也可以与wnt信号级联中的β-连环蛋白相互作用，从而对细胞核癌基因的转录和细胞的增殖起作用。trop2是一种跨膜蛋白，其细胞外结构域在多种肿瘤上过度表达，因此它是靶向治疗发展的天然候选。trop2的组织表达局限性使得治疗的毒性降低，这也是靶向trop2治疗的优势所在。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种靶向trop2的鲨鱼单域抗体5d2，本发明通过筛选得到了全新的鲨鱼单域抗体5d2，其对trop2具有高亲和力和高特异性。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种靶向trop2的鲨鱼单域抗体5d2，其氨基酸序列如seq id no.9所示。

4、进一步的，所述鲨鱼单域抗体5d2包含固定氨基酸序列fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4、高变区域hv2和hv4、互补决定区cdr1和cdr3。

5、本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

6、本发明还提供了包含所述的编码基因的重组质粒。

7、本发明还提供了包含所述的编码基因的重组菌株。

8、本发明所述单域抗体，具有如下优势：

9、1、本发明制备得到的鲨鱼单域抗体5d2分子量小，只有17 kda左右，比传统的单克隆抗体更小；

10、2、所述鲨鱼单域抗体5d2稳定性高、组织渗透性好，比常规抗体更容易储藏与运输，且与trop2具有良好的亲和力和特异性；

11、3、更易表达和基因工程改造，5d2利用大肠杆菌原核表达系统进行表达，并最终得到大量鲨鱼单域抗体；

12、其序列组成为fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4、hv2、hv4、cdr1和cdr3，其中fr1和fr4为固定氨基酸序列，hv2和hv4为高变区域，其影响抗原的结合位点，cdr1和cdr3为抗体的互补决定区，其决定与不同抗原结合。在此情况下，其具有识别trop2的能力。同时，由于其特殊的可变结构域，vnar是分子量最小的抗体结构。因此，vnar克服了传统抗体在应用方面的缺点和不足。此外本发明选择条纹斑竹鲨(chiloscyllium plagiosum)作为抗体制备的模式动物来进行vnar的制备，其不属于濒危鲨鱼种类，且体型小、易于人工繁养，适合用于抗体开发。

13、编码5d2的基因或重组质粒或含有该基因的重组质粒的重组细胞可应用于制备免疫检测诊断试剂盒、流式细胞检测、细胞免疫荧光检测以及肝癌的治疗与诊断。

技术特征：

1.一种靶向trop2的肽段，其特征在于，所述肽段的氨基酸序列为：kaytfhygpqciqpyy。

2.含有权利要求1所述的序列的鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述鲨鱼单域抗体包含固定氨基酸序列fr1和fr4、高变区域hv2和hv4、互补决定区cdr1和cdr3。

3.一种靶向trop2的鲨鱼单域抗体5d2，其特征在于，所述免疫抗体的氨基酸序列如seqid no.11所示。

4.权利要求3所述的鲨鱼单域抗体5d2的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.12所示。

5.包含权利要求4所述的编码基因的重组质粒。

6.包含权利要求4所述的编码基因的重组菌株。

技术总结
本发明公开了一种靶向TROP2的鲨鱼单域抗体5D2，所述靶向TROP2的鲨鱼单域抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备得到的鲨鱼单域抗体5D2分子量小，只有17 kDa左右，比传统的单克隆抗体更小；所述鲨鱼单域抗体5D2稳定性高、组织渗透性好，比常规抗体更容易储藏与运输，且与TROP2具有良好的亲和力和特异性；本发明为肿瘤的治疗及抗体药物的开发奠定了基础。

技术研发人员：汪子健,周业杰,孙晓彤,邱凌希,佘涵诺,段亚彤,崔静婷,孙敏,顾玉超
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/12