一种能实现外源基因定点整合的解脂耶氏酵母菌株及其应用的制作方法

本发明涉及酵母生物，具体涉及到一种能实现外源基因定点整合的解脂耶氏酵母菌株及其应用。

背景技术：

1、近年来，随着基因编辑技术和合成生物学的发展，人们已经实现了对各种非常规的微生物进行遗传改造。优良的底盘菌株对于代谢产物的合成以及遗传改造起到至关重要的作用，因此对于不同的非常规微生物开发出了不同的底盘细胞。解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)是一种非常规产油酵母，具有酵母和假菌丝两种形态，能够利用葡萄糖、甘油、脂肪酸、烃类等物质作为碳源进行生长。在正常条件下，解脂耶氏酵母含油量能够达到细胞干重的20％左右，并且具有高通量的三羧酸循环，能够提供大量的乙酰辅酶a前体用于合成脂溶性物质。不仅如此，它还具有较高的胁迫耐受性，同时还是经过公认的安全微生物(generally regarded as safe,gras)。因此，解脂耶氏酵母常作脂溶性代谢产物的底盘菌株，通过遗传改造从而合成预期的高价值的脂溶性代谢产物。

2、作为一株底盘菌株而言，首先需要有至少一个筛选标记用于筛选改造后的细胞。如果不对筛选标记进行回收，则该筛选标记只能够满足一次改造的需求；然而代谢产物的合成往往需要经过多轮的遗传改造，一个标签无法满足需求。其次，解脂耶氏酵母整合dna的方式主要为非同源末端连接(nhej)，这种方式整合的位置和拷贝数均为随机的。如此一来，不仅会随机破坏其他内源基因，还不利于无表型代谢产物的菌株筛选。

3、综上所述，尽管解脂耶氏酵母是一个良好的脂溶性物质的底盘菌株，但是其具有的筛选标记基因不足以满足其遗传改造的需求，同时dna整合的方式也不足以满足无表型代谢产物改造的需求。此外，现有解脂耶氏酵母还能够分解细胞内的油脂用于生长，这将不利于解脂耶氏酵母细胞内油脂的积累。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种解脂耶氏酵母底盘细胞菌株，该菌株具有四个营养缺陷，同时具有定点整合和积累大量油脂的能力，为解脂耶氏酵母油脂类代谢产物的异源合成提供了良好的酵母底盘，也为解脂耶氏酵母以及其他非常规微生物的基因编辑提供理论和技术基础。

3、(二)技术方案

4、第一方面，本发明提供一种解脂耶氏酵母菌株，命名为yarrowia lipolyticayyye085，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年4月3日，保藏号为cgmcc no.30263，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。

5、第二方面，本发明提供一种能实现外源基因定点整合的解脂耶氏酵母菌株，其为重组解脂耶氏酵母菌株，所述重组酵母菌株敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因、ku70基因和pex10基因。

6、其中，通过敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因以获得营养缺陷表型；通过敲除ku70基因和pex10基因以实现外源基因定点整合和提高解脂耶氏酵母细胞内油脂的积累。

7、根据本发明的较佳实施例，所述重组解脂耶氏酵母菌株以野生型解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)为出发株。

8、根据本发明的较佳实施例，所述敲除采用crispr/cas9基因系统实现。

9、根据本发明的较佳实施例，敲除尿嘧啶合成基因具体为尿嘧啶合成基因在orf区域第4、8、38位碱基缺失；敲除亮氨酸合成基因具体为leu2基因的orf区域第1022位碱基g突变为t，同时第32位碱基后加入gt两个碱基，第43位碱基后加入碱基t，第46位碱基后加入碱基t，第60位碱基后加入碱基a；敲除组氨酸合成基因具体为his3基因的orf区域第165位碱基c缺失；敲除色氨酸合成基因具体为trp1基因的orf区域第34位碱基c变为碱基a，并缺失第36位碱基c。

10、采用基因编辑系统对出发株敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因、ku70基因和pex10基因后，得到yarrowia lipolytica yyye085，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年4月3日，保藏号为cgmccno.30263，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。

11、第三方面，本发明提供一种基于解脂耶氏酵母菌株进行外源基因定点整合的方法，其包括：使用上述方案中的解脂耶氏酵母菌株为底盘菌株，通过转化具有同源臂的基因片段实现外源基因的定点整合。

12、优选地，所述同源臂的长度为500至1000bp。

13、优选地，所述具有同源臂的基因片段括外源基因片段和筛选标记基因片段。在一个实施例中，外源基因片段为胡萝卜素途径相关基因，所述筛选标记基因片段为潮霉素b抗性基因。

14、第四方面，本发明提供解脂耶氏酵母菌株在制备油脂类代谢产物中的应用：通过培养上述方案中的解脂耶氏酵母菌株生产油脂类代谢产物。

15、优选地，所述培养条件为：在ypd培养基中，于29-32℃、200-250rpm转速下培养3d，随后更换为高糖培养基培养5d。高糖培养基的主要成分包含70-80g/l葡萄糖、3-4g/l磷酸二氢钾、13-14g/l磷酸氢二钾。

16、(三)有益效果

17、本发明以野生型解脂耶氏酵母菌株(yarrowia lipolytica)为出发菌株，经过四轮基因敲除，成功敲除了四个营养合成相关基因，获得了四个营养缺陷表型，满足了多轮改造的需求并提高了改造的效率；在此基础上，进一步敲除ku70基因，使外源基因的定点整合的效率从17.05％提高到60.61％，为无表型产物的遗传改造提供便利。此外，通过进一步敲除pex10基因，减少细胞油脂的分解，提高解脂耶氏酵母中油脂的积累，使改造后的重组菌株在高糖胁迫下细胞油脂含量能够从3.38％提高到11.09％。

18、将最终得到的重组解脂耶氏酵母菌株进行命名和保藏，命名为yarrowialipolytica yyye085，保藏编号为cgmcc no.30263。该解脂耶氏酵母菌经多轮传代后，油脂含量没有发生显著的变化，由此推断该菌株具有稳定的遗传性状，可作为解脂酵母合成油脂类高附加值代谢产物的优良底盘菌。

技术特征：

1.一种解脂耶氏酵母菌株，命名为yarrowia lipolytica yyye085，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年4月3日，保藏号为cgmcc no.30263，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。

2.一种能实现外源基因定点整合的解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，其为重组解脂耶氏酵母菌株，所述重组酵母菌株敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因、ku70基因和pex10基因。

3.根据权利要求2所述的解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌株以野生型解脂耶氏酵母为出发株。

4.根据权利要求2或3或4所述的解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述敲除采用crispr/cas9基因系统实现。

5.根据权利要求2或3或4所述的解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌株以野生型解脂耶氏酵母为出发株，采用基因编辑系统对出发株敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因、ku70基因和pex10基因后，得到yarrowialipolytica yyye085，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年4月3日，保藏号为cgmcc no.30263，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。

7.一种基于解脂耶氏酵母菌株进行外源基因定点整合的方法，其特征在于，包括：使用权利要求1-6任一项所述的解脂耶氏酵母菌株为底盘菌株，通过转化具有同源臂的基因片段实现外源基因的定点整合。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述同源臂的长度为500至1000bp。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述具有同源臂的基因片段括外源基因片段和筛选标记基因片段。

10.权利要求1-6任一项所述的解脂耶氏酵母菌株在制备油脂类代谢产物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种解脂耶氏酵母菌株，命名为Yarrowia lipolytica YYYE085，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年4月3日，保藏号为CGMCC No.30263，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。所述为Yarrowia lipolytica YYYE085为重组解脂耶氏酵母菌株，所述重组酵母菌株敲除尿嘧啶合成基因、亮氨酸合成基因、组氨酸合成基因、色氨酸合成基因、ku70基因和pex10基因。所述解脂耶氏酵母菌株具有四个营养缺陷表型，满足多轮改造的需求；还具有定点整合和积累大量油脂的能力以及稳定的遗传性状，为无表型产物的遗传改造提供便利，可作为解脂酵母合成油脂类高附加值代谢产物的优良底盘菌。

技术研发人员：肖奕博,屈玉娇,李安国
受保护的技术使用者：深圳元育生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/15