一种多发性骨髓瘤复发相关的EccDNA分子及其应用

本发明属于肿瘤分子生物学，具体涉及一种多发性骨髓瘤复发相关的eccdna分子及其应用。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(mm)是血液系统的第二大常见肿瘤，发病率每年4.5～6/100000。从1999年到2016年，全球多发性骨髓瘤的发病率增加了126％，这主要归因于人口增长、世界人口老龄化和年龄特异性发病率的增加。新型药物如蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、靶向细胞表面分子的抗体等的使用，以及大剂量疗法和自体干细胞移植(asct)在年轻患者中的应用，显著改善了多发性骨髓瘤患者的预后。符合asct条件的患者的中位总生存期估计约为10年，而不符合移植条件的患者为4～5年。然而，多发性骨髓瘤仍不能治愈，大多数多发性骨髓瘤患者会经历多次疾病复发。目前评估多发性骨髓瘤复发仍然以骨髓穿刺为基础，辅以多种抽血检查，有创操作给患者，尤其病史长多次骨穿的患者，带来了身心的痛苦，寻找复发的血液分子标志物作为多发性骨髓瘤复发的标志有极大的临床价值。

2、染色体外环状dna(eccdna)是一组来源于但又独立于染色体dna、大小和序列不同的，存在于细胞核内的环状双链或单链dna分子。1965年，首次在细胞核内发现了eccdna的存在，2015年后由于circle-seq技术的发展，eccdna的研究逐渐增加。eccdna广泛分布于真核生物，从植物到哺乳动物。一系列研究证实，eccdna在许多生理和病理过程中发挥着重要作用，包括基因扩增、端粒长度修复、基因组可塑性、分子海绵。尽管eccdna产生的机制仍然不太清楚，但有四种被广泛接受的假说模型：断裂-融合桥(bfb)循环、染色体碎裂、游离小体和易位-缺失-扩增模型。根据大小和序列，eccdna可分为五种类型：小多分散dna(spcdna)、microdna、t circle/c circle、erc和ecdna。microdna和ecdna主要存在于肿瘤细胞中，microdna可以转录非编码rna，并在一系列生物过程中发挥调节作用，而ecdna比较长，足以携带完整的基因，从而参与癌基因扩增和基因组异质性。

3、eccdnas由于其闭合的环状结构，对核酸外切酶消化具有抗性。因此，它们比它们的线性对应物更稳定。在循环中鉴定到的一些eccdna，如micro dna，比线性dna长得多，便于检测和动态监测。另外，eccdna具有组织特异性，如eccdna在人卵巢癌/前列腺癌细胞系中具有谱系特异性，在人成纤维细胞和粒细胞中具有细胞类型特异性。综上所述，由于与线性dna相比，ecc dna具有非凡的结构稳定性，因此它们可能是潜在生物标志物的理想来源。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一种多发性骨髓瘤复发相关的eccdna分子。其是利用circle-seq测序鉴定出的一种在复发mm中异常表达的新型eccdna chr17:251547-251698分子，再通过反向pcr(quantitative polymerase chain reaction，pcr)+sanger测序验证其成环属性，最后扩大样本验证该eccdna是复发mm中的广泛存在的分子。

2、所述的多发性骨髓瘤复发相关的eccdna chr17:251547-251698分子序列为：gagtggtgaataaatcctcagtggctcagacgtctgtgtggacccttagtgtcctacaggcaggac accagagtggagaggactgcctgacaggaggaagcagcaaacacacagcagccaccaaggccac cccatctctgaagagctgctg。

3、本发明的第二个目的是提供检测所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤患者诊断制剂中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供检测所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤患者预后制剂中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供检测所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤复发患者诊断和/或预后制剂中的应用。

6、所述的检测eccdna分子试剂包括pcr检测试剂或者原位杂交检测试剂。

7、进一步地，pcr检测试剂包括引物：

8、f：acaggaggaagcagcaaaca

9、r：ggacactaagggtccacacaga。

10、尽管随着新药的不断问世，多发性骨髓瘤的预后较前有了长足的进步，然而，作为血液肿瘤的第二大肿瘤，即使有新药、干细胞移植治疗下，多发性骨髓瘤仍然不能治愈，不可避免地要面临复发。目前复发难治成为了多发性骨髓瘤治疗的当务之急。而多发性骨髓瘤整个病程及复发后反复骨髓穿刺进行评估医疗费用较高，且对病人身心伤害。发现复发时的血液标志物具有较大的临床应用价值。本发明的测序结果显示eccdna广泛存在于骨髓瘤患者中，复发组与缓解组相比，在复发组鉴定出1000余个上调的差异表达eccdna分子，需要注意的是两组相比较，在复发组并未鉴定出下调的差异表达eccdna分子。结合eccdna分子是基因组不稳定的产物，这与多发性骨髓瘤复发组克隆演变，而缓解组无克隆演变相一致。

11、复发是所有的多发性骨髓瘤患者都需要面临的问题，本发明的研究通过circle-seq联合mrna测序鉴定了来自于复发病人的具有显著差异的eccdna chr17:251547-251698分子，并扩大样本验证了它的存在，同时生存曲线也提示它与患者的预后相关。

12、总之，本发明在复发病人中检测到了特殊的eccdna chr17:251547-251698分子，该分子为mm患者复发的标志物提供了新的研究方向。

技术特征：

1.一种多发性骨髓瘤复发相关的eccdna分子，所述的eccdna分子的序列为：

2.检测权利要求1所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤复发患者诊断和/或预后制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测权利要求1所述的eccdna分子试剂包括pcr检测试剂或者原位杂交检测试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，pcr检测试剂包括引物：

5.检测权利要求1所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤患者预后制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的检测权利要求1所述的eccdna分子试剂包括pcr检测试剂或者原位杂交检测试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，pcr检测试剂包括引物：

8.检测权利要求1所述的eccdna分子试剂在制备多发性骨髓瘤患者诊断制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的检测权利要求1所述的eccdna分子试剂包括pcr检测试剂或者原位杂交检测试剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，pcr检测试剂包括引物：

技术总结
本发明公开了一种多发性骨髓瘤复发相关的EccDNA分子及其应用。通过circle‑seq联合mRNA测序鉴定了来自于复发病人的EccDNA <supgt;chr17:251547‑251698</supgt;分子，该分子在多发性骨髓瘤复发患者中异常表达。本发明还通过反向PCR+Sanger测序验证其成环属性，最后扩大样本验证了它的存在，同时生存曲线也提示它与患者的预后相关。该分子为多发性骨髓瘤患者复发的标志物提供了新的研究方向。

技术研发人员：傅云峰,李方方,马金旗,高萌,龙心怡,唐思诗,赵国胜
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/5