抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白及其筛选方法与应用与流程

本发明属于生物医药，涉及抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白及其筛选方法与应用。

背景技术：

1、大口黑鲈（ micropterus salmoides）具有养殖周期短、生长快和经济效益好等优点，但近年来随着养殖密度的提高和养殖环境的恶化，大口黑鲈病害问题日益凸显，严重影响了养殖产业的发展。其中，危害最大的是由大口黑鲈虹彩病毒（largemouth bass virus，lmbv）引起的大口黑鲈虹彩病毒病（largemouth bass virus disease，lmbvd），可造成大口黑鲈大量死亡，死亡率可达到70%以上。

2、与鱼类某些病毒不同的是，lmbv在各种温度下都能杀死细胞，并能在多种细胞系中增殖，但温度对lmbv感染大口黑鲈后的死亡率起到了决定性作用。夏季是lmbvd的高发季节，发病时水温为25~30℃，病鱼的主要症状为失去平衡，倾向于浮在水面，体色发黑，腹部肿胀，并出现特征性增大或鱼鳔发红。

3、接种疫苗被认为是控制水生动物疾病的一种重要手段。疫苗的开发策略有很多，mcp作为大口黑鲈虹彩病毒的主要结构蛋白，在疫苗研究中常被用作分类标记物和主要免疫原。mcp包含多个抗原表位，如何筛选其优势抗原表位对于疫苗的设计至关重要。

4、噬菌体展示是一种高通量筛选技术，也是鉴定抗原表位常用的方法。其中，基于噬菌体展示的抗体库通常是通过直接鉴定抗原来筛选特定的抗体，这种直接鉴定的方法可以有效筛选出具有特定结合能力的抗体。而目前该技术在大口黑鲈虹彩病毒抗体的筛选鉴定以及大口黑鲈虹彩病毒病的防治方面尚待开发。

技术实现思路

1、为了实现lmbv高效防控，本发明基于噬菌体展示技术和噬菌体抗体库淘选等技术手段，筛选出抗大口黑鲈虹彩病毒（lmbv）的单链抗体蛋白ab-s1、ab-s2。对所述单链抗体蛋白和lmbv主衣壳蛋白mcp进行结构模拟，通过分子对接和丙氨酸突变分析，鉴定出lmbv主衣壳蛋白mcp上的优势抗原表位pep1~pep6，并利用所述抗原表位开发出lmbv防治疫苗，本发明提供以下详细的技术方案。

2、本发明首先提供抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白，所述单链抗体蛋白为ab-s1，具有如seq id no:1所示的氨基酸序列；或所述单链抗体蛋白为ab-s2，具有如seq idno:2所示的氨基酸序列。

3、本发明还提供所述单链抗体蛋白的筛选方法，具体包括：

4、1）以大口黑鲈虹彩病毒作为抗原，通过腹腔注射大口黑鲈获得免疫球蛋白；

5、2）根据免疫球蛋白的基因序列信息，设计重链可变区基因引物和轻链可变区基因引物；

6、3）用重链可变区的上游引物和轻链可变区的下游引物进行重叠延伸pcr，扩增出单链抗体基因；

7、4）将所述单链抗体基因与噬菌体载体进行连接，并转化至大肠杆菌，获得原始菌液；

8、5）利用辅助噬菌体侵染所述原始菌液，并通过多轮生物淘选，富集与大口黑鲈虹彩病毒特异性结合的噬菌体；

9、6）通过噬菌体elisa和生物测序鉴定，获得高亲和力单链抗体基因序列；

10、7）构建含有高亲和力单链抗体基因序列的重组表达载体，经过原核表达获得所述单链抗体蛋白。

11、进一步，在所述筛选方法的步骤2）中，扩增重链可变区基因的上游引物为seq idno:3、seq id no:4、seq id no:5；下游引物为seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8。扩增轻链可变区基因的上游引物为seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11；下游引物为seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14。

12、进一步，在所述筛选方法的步骤7）中，用于原核表达的宿主菌为大肠杆菌bl21（de3）。

13、另一方面，本发明还提供所述的单链抗体蛋白在制备大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗中的应用。

14、进一步，在所述应用中，所述大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗的制备方法包括：

15、将单链抗体蛋白和大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白mcp进行结构模拟，通过分子对接和丙氨酸突变分析，鉴定出mcp上发挥关键作用的抗原表位。将所述抗原表位合成多肽，并制备成浓度不低于2mg/ml的多肽溶液，即得所述大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗。

16、进一步，在所述应用中，所述抗原表位的长度为9~24个氨基酸，分别为pep1、pep2、pep3、pep4、pep5和pep6。pep1的氨基酸序列如seq id no:15所示；pep2的氨基酸序列如seqid no:16所示；pep3的氨基酸序列如seq id no:17所示；pep4的氨基酸序列如seq id no:18所示；pep5的氨基酸序列如seq id no:19所示；pep6的氨基酸序列如seq id no:20所示。

17、进一步，在所述应用中，所述大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗采用注射免疫，经注射免疫后，大口黑鲈的特异性抗体水平和相对免疫保护率显著提高。

18、与现有技术相比，本发明“抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白及其筛选方法与应用”至少具有以下有益效果：

19、本发明采用感染lmbv后的大口黑鲈脾脏组织构建噬菌体抗体库，并通过4轮生物淘选，结合噬菌体elisa和基因测序等技术筛选得到两种高亲和力单链抗体蛋白ab-s1和ab-s2。利用蛋白结构模拟和分子对接技术，鉴定出mcp蛋白的6个抗原表位pep1~pep6，基于此构建的lmbv防治疫苗可诱导大口黑鲈产生特异性免疫应答。其中，基于pep6构建的抗原表位疫苗免疫效果最好，其相对免疫保护率为51.72%。表明pep6是一个lmbv的潜在优势抗原表位，该研究结果为鱼源抗体的开发以及高效渔用疫苗的创制提供参考依据与技术支持。

技术特征：

1.抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白，其特征在于，所述单链抗体蛋白为ab-s1，具有如seq id no:1所示的氨基酸序列；或所述单链抗体蛋白为ab-s2，具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的单链抗体蛋白的筛选方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在步骤2）中，扩增重链可变区基因的上游引物为seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5；下游引物为seq id no:6、seq idno:7、seq id no:8；

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在步骤7）中，用于原核表达的宿主菌为大肠杆菌bl21（de3）。

5.权利要求1所述的单链抗体蛋白在制备大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗的制备方法包括：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗原表位的长度为9~24个氨基酸，分别为pep1、pep2、pep3、pep4、pep5和pep6；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述大口黑鲈虹彩病毒防治疫苗采用注射免疫，经注射免疫后，大口黑鲈的特异性抗体水平和相对免疫保护率显著提高。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了抗大口黑鲈虹彩病毒的单链抗体蛋白及其筛选方法与应用。本发明基于噬菌体展示技术和噬菌体抗体库淘选等技术手段，筛选出抗大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）的单链抗体蛋白Ab‑S1、Ab‑S2。对所述单链抗体蛋白和LMBV主衣壳蛋白MCP进行结构模拟，通过分子对接和丙氨酸突变分析，鉴定出LMBV主衣壳蛋白MCP上的优势抗原表位pep1~pep6，并利用所述抗原表位开发出LMBV防治疫苗，所述防治疫苗的免疫保护效果可达到51.72%，这对减少大口黑鲈虹彩病毒病造成的损失、提高养殖效益、促进大口黑鲈养殖产业的健康发展具有重要意义。

技术研发人员：王文博,朱斌,夏军尧,焦铁军,马瑞,孟强,卢静
受保护的技术使用者：深圳万可森生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/15