一种生产戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与发酵放大应用

本发明属于生物，具体涉及一种生产戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与发酵放大应用。

背景技术：

1、戊二胺(尸胺，cadaverine)是一种重要的二胺类平台化合物，单体及其衍生物可与多元酸、多元醇等合成多种高分子聚合物，具有广泛的工业应用前景。目前常用的生产戊二胺的菌株为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌并且相关的基因工程改造报道络绎不绝，然而关于发酵放大生产方面的报道较少。因此，亟需开发一种高效，大体系的生产戊二胺的方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与发酵放大应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种生产戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与发酵放大应用。具体技术方案如下：

3、一种生产戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，是将导入了赖氨酸脱羧酶基因cada同时删除了乳糖操纵子的重组表达载体导入宿主菌中构建得到。

4、优选地，赖氨酸脱羧酶基因cada的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、其中，所述的宿主菌为生产赖氨酸的大肠杆菌，优选为大肠杆菌ka30。所述的大肠杆菌ka30详细信息已公开在中国专利cn113817762b中。

6、优选地，所述的导入为化学转化法导入。

7、其中，所述的重组表达载体，其出发载体为pcdfduet。

8、其中，所述的删除了乳糖操纵子，采用上游引物和下游引物进行反向pcr实现删除；其中，所述的上游引物，其核苷酸序列seq id no.4所示；所述的下游引物，其核苷酸序列seq id no.5所示。

9、优选地，所述的含赖氨酸脱羧酶基因cada和删除乳糖操纵子的重组表达载体按照如下方法构建得到：

10、(1)构建含cada基因的表达载体：以pcdfduet为载体，ncor i和bamh i为酶切位点，通过酶切酶连的方式将cada基因连至pcdfduet中即得；优选地，将基因cada采用上游引物cada-f和下游引物cada-r扩增后得到基因cada片段再连至pcdfduet中。所述的上游引物cada-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的下游引物cada-r的核苷酸序列如seq idno.3所示。

11、(2)删除乳糖操纵子：以步骤(1)得到的含cada基因的表达载体为模板，采用核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的下游引物通过反向pcr将乳糖操纵子删除得到含赖氨酸脱羧酶基因cada和删除乳糖操纵子的重组表达载体。

12、第二方面，本发明提供了第一方面所述的构建方法构建得到的生产戊二胺的重组大肠杆菌。

13、第三方面，本发明提供了第二方面所述的重组大肠杆菌在发酵生产戊二胺中的应用。优选地，所述的戊二胺为1,5-戊二胺。

14、其中，将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，35-37℃发酵培养44-72h。优选地，37℃发酵培养48-72h。更优选的，所述的发酵培养在50l发酵罐中进行。所述的重组大肠杆菌以种子液的形式接种至发酵培养基，种子液以6％v/v的接种量进行接种。

15、其中，在发酵培养至14-16h时，流加发酵补料培养基进行补料，优选地流加速度为2-12.48g/l/h。

16、所述的发酵补料培养基包括600-800g/l葡萄糖水溶液和400-500g/l硫酸铵水溶液；所述的补料，葡萄糖和硫酸铵的补料质量比为1-4:1。优选地，发酵补料培养基配方为800g/l葡萄糖水溶液和500g/l硫酸铵水溶液。

17、其中，所述的发酵培养基，其配方为：玉米浆10-15g/l、硫酸铵15-18g/l、氯化钾0.5-1.0g/l、三水磷酸氢二钾0.5-2.0g/l、七水硫酸镁1.0-2.0g/l、消泡剂1-2ml/l、甜菜碱2-3g/l、葡萄糖45-50g/l、一水合硫酸锰0.05-0.1g/l、七水合硫酸亚铁0.03-0.05g/l、甲硫氨酸0.2-0.5g/l、苏氨酸0.1-0.5g/l；优选地，配方为玉米浆10g/l、硫酸铵16g/l、氯化钾0.5g/l、三水磷酸氢二钾2g/l、七水硫酸镁2g/l、消泡剂2ml/l、甜菜碱2g/l、葡萄糖50g/l、一水合硫酸锰0.077g/l、七水合硫酸亚铁0.032g/l、甲硫氨酸0.3g/l、苏氨酸0.3g/l。

18、其中，所述的发酵培养基，其装液量为40-50％v/v。

19、其中，所述的发酵培养，溶氧为5％-35％，ph为6.5-7.0。优选地，ph为6.8，溶氧为15％-20％，通气量为2vvm。其中，所述的ph通过氨水调整，所述的通气量通过转速与溶氧偶联控制。

20、有益效果：

21、本发明的目的在于提供生产戊二胺的重组菌株以及菌株发酵放大工艺，实现了重组菌株在大容量发酵罐中不添加诱导剂的发酵放大培养。

22、本发明在重组菌的构建上删除了乳糖操纵子，避免了诱导剂的使用，减少了成本；在5l发酵罐上对重组菌发酵的补料方式、发酵ph和溶氧均进行了优化，最终重组菌在5l发酵罐中可发酵生产110.7g/l的1,5-戊二胺，转化率达到0.35g/g；此外，本发明还在50l发酵罐上进行了发酵放大验证，最终1,5-戊二胺产量为97g/l，生产速率为1.34g/l/h，转化率为0.34g/g。

技术特征：

1.一种生产戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将导入了赖氨酸脱羧酶基因cada同时删除了乳糖操纵子的重组表达载体导入宿主菌中构建得到。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的宿主菌为生产赖氨酸的大肠杆菌，优选为大肠杆菌ka30。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的重组表达载体，其出发载体为pcdfduet。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的删除了乳糖操纵子，采用上游引物和下游引物进行反向pcr实现删除；

5.权利要求1-4中任意一项所述构建方法构建得到的生产戊二胺的重组大肠杆菌。

6.权利要求5所述的重组大肠杆菌在发酵生产戊二胺中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，35-37℃发酵培养44-72h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在发酵培养至14-16h时，流加发酵补料培养基进行补料；优选的，所述的发酵补料培养基包括600-800g/l葡萄糖水溶液和400-500g/l硫酸铵水溶液；进一步优选的，所述的补料，葡萄糖和硫酸铵的补料质量比为1-4:1。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基，其配方为：玉米浆10-15g/l、硫酸铵15-18g/l、氯化钾0.5-1.0g/l、三水磷酸氢二钾0.5-2.0g/l、七水硫酸镁1.0-2.0g/l、消泡剂1-2ml/l、甜菜碱2-3g/l、葡萄糖45-50g/l、一水合硫酸锰0.05-0.1g/l、七水合硫酸亚铁0.03-0.05g/l、甲硫氨酸0.2-0.5g/l、苏氨酸0.1-0.5g/l；所述的发酵培养基，其装液量为40-50％v/v。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养，溶氧为5％-35％，ph为6.0-7.0。

技术总结
本发明公开了一种生产戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与发酵放大应用。本方面以产赖氨酸的大肠杆菌KA30为底盘，过表达赖氨酸脱羧酶(cadA)。为了减少诱导剂的使用成本，删除了乳糖操纵子。将所述的重组大肠杆菌在50L发酵罐以固定的比例补入葡萄糖与硫酸铵进行发酵，实现了戊二胺的高效率转化。本发明解决了目前的生产方法中戊二胺转化率不高的技术问题。

技术研发人员：许晟,王永涛,陈可泉,王昕,廖杨,冯佳,冯娇
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/8/21