一种球形核酸底物增强的CRISPR-Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种球形核酸底物增强crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒（african swine fever virus, 非洲猪瘟病毒）引发的烈性猪病，通过与感染宿主的直接、简介的接触、或者以蜱虫为媒介进行传播，致死率高达100%。一经爆发，往往导致生猪产量的严重减产以及严格的进出口贸易限制，严重危害疫区养殖业与经济。为了实现尽早控制传染源扩散，需要对感染动物及时的发现、隔离处理。因此，开发针对非洲猪瘟病毒的快速、灵敏、便捷的检测方法对于公共卫生安全和社会经济的稳定发展至关重要。

2、目前作为核酸检测金标准的pcr（qpcr）技术，具有较高的检测灵敏度和定量分析能力，但其反应过程涉及到逆转录和核酸扩增等步骤易发生交叉感染，且无法摆脱仪器设备进行临场检测。免核酸扩增的直接对目标基因片段进行直接检测不仅可以避免核酸扩增所带来的不利因素，还可以简化检测步骤，提高检测方法的临场检测能力。

3、crispr系统广泛存在于细菌和古细菌的免疫系统中，其中crispr-cas12a系统可以在引导rna的引导下识别靶标dna，进而激活高效的反式裂解活性随机裂解周围的单链dna报告子，从而具备较好的信号放大能力。然而，单独使用crispr-cas12a系统时的灵敏度仅能达到pm水平，这并不能满足低浓度非洲猪瘟病毒的检测。因此，为了实现高灵敏度、快速、便捷的检测非洲猪瘟病毒，需要对crispr-cas12a系统的反应能力进一步增强：即增强lbcas12a-引导rna复合物对底物的亲和力，增强该系统的信号放大效率，使其能够免扩增、高效检出低浓度非洲猪瘟病毒。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：提供基于环结构球形核酸底物增强crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其具有操作简便、灵敏度高、免扩增的优点。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

3、一种基于环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其包括：

4、s1、环结构球形核酸底物的合成；

5、所述环结构球形核酸底物包括链霉亲和素化磁珠、生物素标记的rna g4 单链、荧光及猝灭基团标记的单链dna和合成缓冲溶液，并于室温反应合成；

6、s2、将上述环状结构球形核酸底物与lbcas12a效应蛋白、引导rna、反应缓存液混合，配置成预混反应液；

7、s3、将包含目标核酸的待测物与上述预混反应液混合，并孵育反应；

8、s4、完成孵育后读取反应单元中的荧光强度，判定阳性/阴性信号；

9、s5、在上述反应单元中继续加入四甲基联苯胺显色液和氯化血红素后，读取比色信号，判定阳性/阴性信号；

10、进一步，步骤（1）中所述的荧光及猝灭基团标记的单链dna应与生物素标记的rna单链碱基互补配对并形成单链状态的环状突起结构，其突起部分碱基序列为：ttattt。

11、进一步，步骤（1）中所述链霉亲和素化磁珠浓度为0.5-4mg/ml，生物素标记的rnag4 单链浓度为600-1000nm、荧光及猝灭基团标记的单链dna浓度为400-1600nm；

12、优选步骤（1）中所述链霉亲和素化磁珠浓度为2mg/ml，生物素标记的rna g4 单链浓度为800nm、荧光及猝灭基团标记的单链dna浓度为800nm。

13、进一步，步骤（1）中所述的生物素标记的rna g4 单链序列为:uuuggguagggcggguuggg（seq id no:4）。

14、进一步，步骤（2）中所述的引导rna为根据非洲猪瘟病毒（b646l）的region1、region2、region3设计的全新引导rna，包括引导rna1、引导rna2、引导rna3。

15、进一步，步骤（2）中所述的引导rna为引导rna1、引导rna2、引导rna3混合添加，其浓度摩尔比为1：1：1。

16、进一步，步骤（2）中所述的lbcas12a效应蛋白浓度为20-200nm；环结构球形核酸底物浓度为0.5-4mg/ml；

17、优选步骤（2）中所述的lbcas12a效应蛋白浓度为40nm；环结构球形核酸底物浓度为2mg/ml。

18、进一步，步骤（1）中fam荧光基团的激发波长为480nm~520nm。

19、进一步，四甲基联苯胺显色液的体积为100~500μl，优选为200μl；氯化血红素浓度为1~10mm，优选为5mm。

20、本发明实施所述基于环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其通过在底物中引入环状结构区域提升lbcas12a-引导rna复合晶体对底物的亲和力，同时利用链霉亲和素化纳米磁珠负载构建底物，进一步提升底物的局部浓度从而能够极大程度的增强crispr-cas12a体系的反应效率，避免了在反应体系中引入前置核酸步骤，从而在有效规避了交叉感染风险，简化了操作步骤。同时，在底物中引入rna g4结构，其能够在稳定连接荧光及猝灭基团标记的单链dna的同时，充当比色信号报告子，实现荧光、比色双信号输出，进一步拓展了该方法临场检测的潜力。

21、在上述技术方案的基础上，与现有技术相比，本发明的优点在于：

22、本发明构建的检测方法无需前置核酸扩增反应，即可实现高特异性的、超灵敏的检测；

23、利用多个引导rna靶向非洲猪瘟病毒的不同和区域以提升检测的灵敏度的同时，可以进一步降低反应的背景信号，确保检测结果的准确度，且无需内参校正；

24、荧光比色双信号输出方式，在确保检测的同时，能够在无需任何仪器的条件下对非洲猪瘟病毒进行临场检测。

技术特征：

1.一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（1）所述的fam荧光基团及bhq1黑洞淬灭基团标记的单链dna应与生物素标记的rna g4单链碱基互补配对并形成单链状态的环状突起结构，其突起部分碱基序列为：ttattt。

3.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（1）所述的链霉亲和素化磁珠浓度为0.5-4mg/ml，生物素标记的rna g4 单链浓度为600-1000nm、fam荧光基团及bhq1黑洞淬灭基团标记的单链dna浓度为400-1600nm。

4.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（1）所述生物素标记的rna g4单链序列如seqid no:4所示。

5.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（2）所述引导rna根据非洲猪瘟病毒b646l的识别位点1、识别位点2、识别位点3，设计的全新引导rna，包括引导rna1、引导rna2、引导rna3，所述引导rna1、引导rna2、引导rna3的序列如seq id no:5-7所示。

6.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（2）所述引导rna为引导rna1、引导rna2、引导rna3混合添加，其浓度摩尔比为1：1：1。

7.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（2）所述的lbcas12a效应蛋白浓度为40nm，环结构球形核酸底物浓度为0.5-4mg/ml。

8.如权利要求1所述的一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的crispr-cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于步骤（1）所述的fam荧光基团的激发波长为480nm~520nm。

技术总结
本发明涉及一种球形核酸底物增强的CRISPR‑Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法。检测方法包括：（1）构建环状球形核酸底物；（2）将环结构球形核酸、引导RNA、LbCas12a效应蛋白配置成预混反应液：（3）将待测基因片段与预混反应液混合，孵育反应;（4）读取荧光信号，判定阳性/阴性信号；（5）加入显色液，与对照色卡进行比对。本方法利用环结构球形核酸有效增强了LbCas12a效应蛋白与底物的亲和力，提升CRISPR‑Cas12a信号放大能力，避免额外引入核酸扩增步骤从而引起的交叉污染、操作复杂、反应时间长的问题，同时还将荧光和比色相结合，进一步拓宽了该方法针对非洲猪瘟病毒的临场检测能力。

技术研发人员：张祯,戴嘉辉,崔键,曾昆,李金凤,王津,蔡籽年,周嘉龙
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/7/25