重组需钠弧菌及促进外源蛋白分泌表达的方法

本发明属于发酵工程，更具体地说，本发明涉及一种重组需钠弧菌、以及一种利用该重组需钠弧菌促进外源蛋白分泌表达的方法。

背景技术：

1、需钠弧菌(vibrio natriegens)是从美国佐治亚州萨佩洛岛的盐沼泥中分离到的一种革兰氏阴性海洋细菌。于1958年首次发现，它是迄今报道的生长最快的非致病性细菌，倍增时间约7～10分钟。

2、2016年以前，关于需钠弧菌的研究主要停留在揭示其生理生化特性及快速生长机制。2016年国外研究者首次提供了一个完整的需钠弧菌基因组，由两条闭合的3.24mb(chr1)和1.92mb(chr2)的环状染色体组成，共编码4578个开放阅读框，总基因组大小约为5.17mb，比大肠杆菌基因组大0.5mb以上。有两个主要机制促成了需钠弧菌的快速增长。首先，在指数生长期，需钠弧菌的核糖体数量可以达到每细胞11.5万个，比大肠杆菌多30～60％。其次，需钠弧菌的5.17mb基因组分布在两条染色体上，可以从两个复制起点同时开始平行复制。需钠弧菌在42℃以下所有测试温度中，在富含和最低限度的培养介质中的生长速度都超过了大肠杆菌，其中37℃时的生长速度最快。需钠弧菌在富集培养基中的生长速度是大肠杆菌的1.4～2.2倍，在添加葡萄糖的最低培养基中为1.6～3.9倍。蔗糖是一种廉价的发酵原料，目前大多数商用大肠杆菌菌株都不能利用蔗糖，而需钠弧菌在蔗糖上也能快速生长，37℃时，需钠弧菌在含3％nacl的高盐lb培养基中的倍增时间为14.8min，比大肠杆菌的倍增时间(31.3min)快2.1倍。需钠弧菌还具有广泛的ph耐受性，最适生长ph为7.5。这些机制使需钠弧菌能够实现高生物量和高蛋白质表达量，使其成为蛋白质表达和代谢工程的下一代主力宿主。

3、随着dna重组技术和基因组技术的迅速发展，需钠弧菌的全基因组序列被公开和注释，相关遗传工具和方法被揭示，最终验证了需钠弧菌作为异源蛋白表达宿主的可行性。目前，对需钠弧菌作为异源表达宿主的研究主要包括遗传转化方法的确定与优化、t7表达系统的兼容性评估和无细胞蛋白表达系统的建立等。现阶段配适t7表达系统的需钠弧菌具有较好的外源蛋白可溶性表达能力，但大部分外源蛋白只能在胞内表达，无法实现分泌表达。

4、从工业生产的角度，外源蛋白的分泌表达更有利于外源蛋白的分离纯化，能减少纯化步骤，降低下游纯化工艺成本。目前关于需钠弧菌分泌表达外源蛋白的研究较少，主要是从基因层面筛选信号肽的方法来实现外源蛋白的分泌，研发周期长、成本高且不具备普适性。

5、因此，开发一种简单的、周期短、具有普适性的利用需钠弧菌来促进外源蛋白分泌表达的方法具有重要指导意义。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种重组需钠弧菌及促进外源蛋白分泌表达的方法，将携带外源蛋白的重组质粒转化转化至本发明的重组需钠弧菌中，采用本发明的方法进行发酵培养，可以促进外源蛋白分泌表达。

2、实现上述发明目的的具体技术方案包括如下。

3、本发明的第一方面，提供了一种重组需钠弧菌，其是以保藏编号为cicc 10908的需钠弧菌为底盘细胞，在其基因组上敲除脱氧核糖核酸酶基因，并插入t7 rna聚合酶和氨基糖苷腺苷酸转移酶的组合表达盒后构建而得。

4、本发明的第二方面，提供了上述重组需钠弧菌的构建方法，包括以下步骤：

5、(1)以大肠杆菌bl21(de3)基因组dna为模板，seq id no:7和seq id no:8为引物，pcr扩增得到t7 rnacassette；

6、(2)以需钠弧菌基因组dna为模板，分别以seq id no:5和seq id no:6、以及seqid no:11和seq id no:12为引物进行pcr扩增，得到核苷酸序列为seq id no:3的al序列和核苷酸序列为seq id no:4的ar序列；

7、(3)以质粒ptargetf为模板，以seq id no:9和seq id no:10为引物进行质粒ptargetf的线性化扩增；

8、(4)通过无缝克隆技术将t7 rnacassette、al和ar构建至线性化质粒ptargetf得到重组质粒，再将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态；

9、(5)以seq id no:13和seq id no:14为引物，pcr扩增得到al-t7-smr-ar表达盒，回收得到al-t7-smr-ar表达盒dna片段；

10、(6)将所述al-t7-smr-ar表达盒dna片段电击转化至需钠弧菌中，即得。

11、本发明的第三方面，提供了上述重组需钠弧菌在促进外源蛋白分泌表达中的应用。

12、本发明的第四方面，提供了一种促进外源蛋白分泌表达的方法，包括以下步骤：

13、(1)、将携带外源蛋白的重组质粒转化至上述重组需钠弧菌中，获得产外源蛋白的重组需钠弧菌；

14、(2)、将上述产外源蛋白的重组需钠弧菌的种子液接种至发酵培养基中，培养至对数生长中期，添加终浓度0.1～1mm的iptg和终浓度40g/l～100g/l的nacl，再继续培养，至总培养时间为22～24h，得到含有外源蛋白的发酵液。

15、本发明具有以下有益效果：

16、在本发明中，发明人以保藏编号为cicc 10908的需钠弧菌为底盘细胞，敲除了脱氧核糖核酸酶基因，并插入了t7 rna聚合酶和氨基糖苷腺苷酸转移酶的组合表达盒，从而构建得到了一种重组需钠弧菌。并将携带外源蛋白的重组质粒转化至该重组需钠弧菌中，在进行了发酵方法的研究中发现，在产外源蛋白的重组需钠弧菌发酵至一定时候(对数生长中期)添加一定浓度的nacl(终浓度为40～100g/l，优选为40～60g/l)，可以显著提高外源蛋白的分泌表达量。本发明首次从发酵水平解决了需钠弧菌分泌表达外源蛋白的问题，相比胞内表达，重组蛋白的分泌表达提高了产物分离纯化工艺的生产效率，降低下游纯化成本；且本发明的方法具有一定普适性，实现了多个外源蛋白(tgp、tbchi、gmgl和lysd6e)的分泌表达，为需钠弧菌工程菌在蛋白质工程和发酵工程领域的研究提供了技术指导。

技术特征：

1.一种重组需钠弧菌，其特征在于，其是以保藏编号为cicc 10908的需钠弧菌为底盘细胞，在其基因组上敲除脱氧核糖核酸酶基因，并插入t7 rna聚合酶和氨基糖苷腺苷酸转移酶的组合表达盒后构建而得。

2.根据权利要求1所述的重组需钠弧菌，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述t7 rna聚合酶和氨基糖苷腺苷酸转移酶的组合表达盒的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.权利要求1或2所述的重组需钠弧菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.权利要求1或2所述的重组需钠弧菌在促进外源蛋白分泌表达中的应用。

5.一种促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，步骤(2)中所述nacl的终浓度为40g/l～60g/l。

7.根据权利要求5所述的促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，步骤(2)中所述对数生长中期是根据产外源蛋白的重组需钠弧菌的生长曲线而确定的；和/或，步骤(1)中所述外源蛋白为绿色荧光蛋白tgp、几丁质酶tbchi、脂肪酶gmgl或噬菌体裂解酶lysd6e；和/或，步骤(1)中所述携带外源蛋白的重组质粒为pet28a-tgp、pet30a-gmgl、pet28a-lysd6e或pet28a-tbchi。

8.根据权利要求7所述的促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，步骤(1)中所述产外源蛋白的重组需钠弧菌为产绿色荧光蛋白的重组需钠弧菌，步骤(2)中所述对数生长中期为培养2～4h时，优选为培养2h时。

9.根据权利要求5～8任一项所述的促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子液的接种量为1～5％，优选为4～5％。

10.根据权利要求5所述的促进外源蛋白分泌表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种重组需钠弧菌及促进外源蛋白分泌表达的方法，其是以保藏编号为CICC 10908的需钠弧菌为底盘细胞，在其基因组上敲除脱氧核糖核酸酶基因，并插入T7RNA聚合酶和氨基糖苷腺苷酸转移酶的组合表达盒后构建而得。将携带外源蛋白的重组质粒转化至上述重组需钠弧菌中，将种子液接种至发酵培养基中，培养至对数生长中期，添加IPTG和NaCl，再继续培养，得到含有外源蛋白的发酵液。本发明首次从发酵水平解决了需钠弧菌分泌表达外源蛋白的问题，培养时间短、成本低，且具有一定普适性，为需钠弧菌工程菌在蛋白质工程和发酵工程领域的研究提供了技术指导。

技术研发人员：廖兆民,王永华,蓝东明,杨博
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31