七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系优化与开发应用

本发明涉及分子生物学，特别涉及七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系及其应用。

背景技术：

1、七叶一枝花(parispolyphylla smith)根据恩格勒系统分为百合科(liliaceae)重楼属(paris)的多年生草本植物，别名为华重楼，为《中国药典》收载的重楼药材两个基原植物之一，是我国常用的传统中药。分布在我国云南、浙江、贵州、福建、重庆、广西、湖南、湖北等地区。七叶一枝花具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊、抗肿瘤、抑菌、消炎、镇痛、止血、保护心血管等作用，为云南白药、片仔癀、宫血宁胶囊、季德胜蛇药、痛血康等80多种国药准字号中成药的主要原料之一。

2、遗传多样性的本质是遗传物质变异，探索遗传多样性是研究植物进化和亲缘关系的基础。简单重复序列区间标记(inter-simple sequence repeat，issr)是分子标记的一种，issr技术被广泛应用于不同类型植物的遗传多样性检测。issr是一种基于pcr技术的分子标记方法，pcr反应体系因组分配比不同对试验结果影响显著，且不同物种间最佳的pcr反应体系也差异显著。综上，针对七叶一枝花建立issr-pcr体系并进行优化是开展七叶一枝花种质资源利用的关键步骤，但该物种此前并无相关研究或方法未被报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系及其应用。七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系为：每10μl反应体系中含有模版dna 1μl(50ng/μl)，引物0.2μl(10μmol/l)，2×tap mastermix 5μl(tap dna聚合酶、延申促进因子、dntps)，dd h2o为3.8μl，所述的引物为ubc824、ubc834、ubc835、ubc844、ubc864、ubc866、ubc873、ubc874、ubc878、ubc881的任意一条，所述反应体系对七叶一枝花品种(系)进行issr-pcr分子标记进行检测，结果稳定可靠。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了issr-pcr引物组在七叶一枝花遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种中的应用，所述issr-pcr引物组具有：

4、(i)如seq id no.1～10所示核苷酸序列中的任意一个或多个核苷酸序列；或

5、(ii)、具有与(i)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

6、(iii)、具有与(i)或(ii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

7、(iv)、具有与(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

8、本发明还提供了七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系，包括：每10μl反应体系中含有模版dna 5ng/μl，引物0.2μmol/l，2×tap mastermix 5μl，dd h2o补足至10μl；所述引物具有：

9、(i)如seq id no.1～10所示核苷酸序列中的任意一个或多个核苷酸序列；或

10、(ii)、具有与(i)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

11、(iii)、具有与(i)或(ii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

12、(iv)、具有与(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

13、在本发明的一些具体实施方案中，所述分子标记的扩增程序包括：94℃预变性5min，95℃变性15s，48.5～63.2℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸6min。

14、在本发明的一些具体实施方案中，所述退火的温度根据所选择的引物来确定，包括：

15、

16、本发明还提供了试剂盒，包括所述分子标记体系。

17、本发明还提供了如下任意项在七叶一枝花遗传多样性分析中的应用：

18、(i)、所述分子标记体系；和/或

19、(ii)、所述试剂盒。

20、本发明还提供了七叶一枝花issr-pcr标记方法，包括如下步骤：

21、步骤1、提取七叶一枝花样本的基因组dna；

22、步骤2、采用所述分子标记体系或所述的试剂盒，对步骤1所述基因组dna进行issr-pcr扩增。

23、本发明还提供了七叶一枝花遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：

24、步骤1、提取七叶一枝花样本的基因组dna；

25、步骤2、采用所述分子标记体系或所述试剂盒，对步骤1所述基因组dna进行issr-pcr扩增，获得pcr扩增产物；

26、步骤3、将步骤2所述的pcr扩增产物进行电泳分离，获取电泳条带信息；

27、步骤4、计算遗传相似系数，构建系统发育树。

28、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述七叶一枝花样本包括七叶一枝花的嫩叶。

29、在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述电泳分离包括采用1.5％琼脂糖凝胶电泳。

30、在本发明的一些具体实施方案中，步骤4具体包括：采用ntsyspc 2.10e计算个体间的遗传相似系数；采用upgma构建系统发育树。

31、本发明包括但不限于提供了如下有益效果：

32、本发明以优化后的扩增反应体系对不同引物进行退火温度筛选，探究引物的最佳退火温度，确定七叶一枝花最佳反应体系：10μl反应体系中含有模版dna 1μl(50ng/μl)，引物0.2μl(10μmol/l)，2×tap mastermix 5μl(tap dna聚合酶、延申促进因子、dntps)，ddh2o为3.8μl。利用优化后反应体系筛选出10条引物(ubc824、ubc834、ubc835、ubc844、ubc864、ubc866、ubc873、ubc874、ubc878、ubc881)的最佳退火温度，依次为53.0℃、55.8℃、56.3℃、52.3℃、51.2℃、63.2℃、51.9℃、60.8℃、48.5℃、54.3℃。采用优化后的反应体系对15个七叶一枝花品种(系)进行issr-pcr分子标记检测，结果反应上述反应体系稳定可靠。通过建立及优化七叶一枝花issr-pcr体系，获得其分子标记的稳定体系，为后续开展七叶一枝花资源保护和利用奠定了工作基础。

技术特征：

1.issr-pcr引物组在七叶一枝花遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种中的应用，所述issr-pcr引物组具有：

2.七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系，其特征在于，包括：每10μl反应体系中含有模版dna 5ng/μl，引物0.2μmol/l，2×tap mastermix 5μl，dd h2o补足至10μl；所述引物具有：

3.如权利要求2所述的分子标记体系，其特征在于，所述分子标记的扩增程序包括：94℃预变性5min，95℃变性15s，48.5～63.2℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸6min。

4.如权利要求3所述的分子标记体系，其特征在于，所述退火的温度根据所选择的引物来确定，包括：

5.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2至4任一项所述的分子标记体系。

6.如下任意项在七叶一枝花遗传多样性分析中的应用：

7.七叶一枝花issr-pcr标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.七叶一枝花遗传多样性分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3所述电泳分离包括采用1.5％琼脂糖凝胶电泳。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤4具体包括：采用ntsyspc 2.10e计算个体间的遗传相似系数；采用upgma构建系统发育树。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及七叶一枝花种质特异性、多样性鉴定的分子标记体系及其应用。ISSR‑PCR最佳反应体系为：每10μL反应体系中含有模版DNA 1μL(50ng/μL)，引物0.2μL(10μmol/L)，2×Tap Master Mix 5μL((Tap DNA聚合酶、延申促进因子、dNTPs))，dd H2O为3.8μL，所述的引物为UBC824、UBC834、UBC835、UBC844、UBC864、UBC866、UBC873、UBC874、UBC878、UBC881的任意一条，所述反应体系对七叶一枝花品种(系)进行ISSR‑PCR分子标记进行检测，结果稳定可靠。

技术研发人员：谢倩,陈清西,刘玲玲,丁明月,王威
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/12