一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法和应用。

背景技术：

1、桦褐孔菌又称白桦茸，是一种生长在桦树上的食药用真菌，也叫桦树茸。桦褐孔菌能够调节内分泌并提高胰腺功能，还能促进胰岛素分泌，能抑制人体对糖类物质的吸收，经常食用能稳定血糖，阻止血糖升高；桦褐孔菌还具有防癌、抗辐射的功效。因此，桦褐孔菌提取物被广泛应用于食品和药品中。

2、桦褐孔菌中含有一定的超氧化物歧化酶（sod），超氧化物歧化酶具有清除体内有氧自由基的作用。在化妆品中能够起到抗氧、抗衰、祛斑、抗炎、修护的皮肤调理功效；在医药中能够用于防治动脉粥样硬化、高血脂引起的心脑血管疾病、红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎、肺气肿、老年性白内障等疾病。

3、现有的超氧化物歧化酶分为三种，即mn-sod、fe-sod和cu-zn-sod。其中，含mn型sod能够从真核细胞或原核细胞中分离获得，含fe型sod能够从原核细胞中分离获得，含cu-zn型的sod能够从真核细胞中分离获得。

4、目前，超氧化物歧化酶在细胞中的分离产率还是较低，价格昂贵，酶活性（酶活力）也良莠不齐，满足不了日益庞大的使用需求量和日益提高的使用需求。

技术实现思路

1、针对现有超氧化物歧化酶在细胞中的分离产率还是较低，价格昂贵，酶活性（酶活力）也良莠不齐，满足不了日益庞大的使用需求量和日益提高的使用需求问题。本发明提供一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法和应用，本发明方法采用桦褐孔菌作为原料，经处理液浸泡处理提高超氧化物歧化酶产率和活性，经两步纯化，提高超氧化物歧化酶的纯度，能够大幅提高超氧化物歧化酶液对基物作用的总活性，能够提高活性达到200000u/g以上；另外，本发明方法在提高超氧化物歧化酶品质的同时，不会大幅增加成本。其具体技术方案如下：

2、一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，包括如下步骤：

3、s1：取桦褐孔菌，按质量比，桦褐孔菌:处理液=1:（5～8），将桦褐孔菌浸泡在处理液中，浸泡30h～40h，取出桦褐孔菌，水洗去除处理液，得到处理后的桦褐孔菌；

4、所述处理液的成分质量比为，水:乙醇:黄嘌呤:次黄嘌呤:咖啡因:神经酸=100:（10～20）:（0.1～0.3）:（0.1～0.3）:（3～5）:（0.5～2）；

5、s2：按质量比，处理后的桦褐孔菌:水=1:（0.5～1），进行配比，细胞破壁打浆，得到浆液a；向浆液a中加入kh2po4-k2hpo4缓冲溶液，搅拌混合浸泡6h～8h，离心，收集上清液，得到酶粗提液，喷雾干燥，得到酶粗提物；

6、s3：按质量比，酶粗提物:kh2po4-k2hpo4缓冲溶液=1:（4～5），将酶粗提物分散于kh2po4-k2hpo4缓冲溶液中，采用盐酸溶液调节ph5.3～5.5，离心，收集上清液，得到酶精提液；

7、s4：将酶精提液采用超滤管离心过滤，滤芯为10kda和60kda超滤膜，截取10kda至60kda之间的滤液，浓缩，冻干，得到超氧化物歧化酶。

8、上述制备方法的s1中，所述浸泡的温度为30℃～38℃。

9、上述制备方法的s1中，所述处理液的制备方法为：按质量比，将水升温至80℃～95℃，加入黄嘌呤和次黄嘌呤进行溶解，降温至50℃以下，加入乙醇，混合均匀后，加入咖啡因和神经酸，溶解均匀，降温至30℃～38℃，得到处理液。

10、上述制备方法的s2中，所述kh2po4-k2hpo4缓冲溶液的加入量为浆液a质量的5倍～8倍。

11、上述制备方法的s2中，所述搅拌混合浸泡的转速为100r/min～200r/min，温度为40℃～50℃。

12、上述制备方法的s2中，所述离心的转速为3000r/min～4000r/min，时间为15min～20min。

13、上述制备方法的s2和s3中，所述kh2po4-k2hpo4缓冲溶液的组成均为：，15wt%～20wt%的kh2po4、15wt%～20wt%的k2hpo4和余量的溶剂水。

14、上述制备方法的s3中，所述盐酸溶液为1.5mol/l盐酸溶液。

15、上述制备方法的s3中，所述离心的转速为3500r/min～4000r/min，时间为15min～20min。

16、上述一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法获得超氧化物歧化酶，用于制备药品或化妆品。

17、本发明提供的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法和应用，与现有技术相比，有益效果为：

18、一、本发明将新摘的桦褐孔菌采用处理液浸泡处理，处理液中含有黄嘌呤、次黄嘌呤、咖啡因、神经酸四种活性物质，四种物质按一定比例和浓度配置，经桦褐孔菌吸收后，能够适当的刺激提高桦褐孔菌分泌合成超氧化物歧化酶，提高超氧化物歧化酶在桦褐孔菌中的含量，进而提高超氧化物歧化酶的产率，最高达到6.4%；另外，四种物质按一定比例和浓度配置，经桦褐孔菌吸收后，能够适当提高细胞活性以及提高细胞内超氧化物歧化酶的抗氧化、消除自由基的活力。

19、二、本发明方法在粗提超氧化物歧化酶后，将酶粗提物分散于kh2po4-k2hpo4缓冲溶液中，在ph5.3～5.5下，离心，能够去除蛋白质沉淀杂质，起到良好的提纯作用。

20、三、本发明方法将酶精提液采用超滤管离心过滤，获得截取10kda至60kda之间的产物，能够进一步提纯超氧化物歧化酶，去除10kda以下和60kda以上的杂质，使超氧化物歧化酶的纯度达到91wt％以上，相对提高超氧化物歧化酶液对基物作用的总活性。

21、综上，本发明方法采用桦褐孔菌作为原料，经处理液浸泡处理提高超氧化物歧化酶产量和活性，经两步纯化，提高超氧化物歧化酶的纯度，能够大幅提高超氧化物歧化酶液对基物作用的总活性；在通常情况下，桦褐孔菌原料中超氧化物歧化酶活性为35000u/g左右，本发明经过提取后的超氧化物歧化酶，能够提高活性达到200000u/g以上；另外，本发明方法在提高超氧化物歧化酶品质的同时，不会大幅增加成本，具有良好的实用价值。

技术特征：

1.一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s1中，所述浸泡的温度为30℃～38℃。

3.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s1中，所述处理液的制备方法为：按质量比，将水升温至80℃～95℃，加入黄嘌呤和次黄嘌呤进行溶解，降温至50℃以下，加入乙醇，混合均匀后，加入咖啡因和神经酸，溶解均匀，降温至30℃～38℃，得到处理液。

4.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s2中，所述kh2po4-k2hpo4缓冲溶液的加入量为浆液a质量的5倍～8倍。

5.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s2中，所述搅拌混合浸泡的转速为100r/min～200r/min，温度为40℃～50℃。

6.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s2中，所述离心的转速为3000r/min～4000r/min，时间为15min～20min。

7.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s2和s3中，所述kh2po4-k2hpo4缓冲溶液的组成均为：15wt%～20wt%的kh2po4、15wt%～20wt%的k2hpo4和余量的溶剂水。

8.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s3中，所述盐酸溶液为1.5mol/l盐酸溶液。

9.根据权利要求1所述的一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，s3中，所述离心的转速为3500r/min～4000r/min，时间为15min～20min。

10.一种超氧化物歧化酶的应用，超氧化物歧化酶由权利要求1所述的制备方法获得，其特征在于，超氧化物歧化酶用于制备药品或化妆品。

技术总结
本发明涉及一种从桦褐孔菌中提取超氧化物歧化酶的制备方法和应用，属于生物技术领域，本发明制备方法采用桦褐孔菌作为原料，经处理液浸泡处理，处理液的成分包含乙醇、黄嘌呤、次黄嘌呤、咖啡因和神经酸，浸泡处理后能够提高超氧化物歧化酶产率和活性，在破壁提取后，经两步纯化，提高超氧化物歧化酶的纯度，能够大幅提高超氧化物歧化酶液对基物作用的总活性；另外，本发明方法在提高超氧化物歧化酶品质的同时，不会大幅增加成本。

技术研发人员：魏磊
受保护的技术使用者：广州滋得洛夫生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/13