一种猴头菌沪猴8号菌株MNP标记的多重PCR扩增及其基因型鉴定方法

本发明属于猴头菌菌种的检测领域，具体涉及一种猴头菌沪猴8号菌株mn p标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法。

背景技术：

1、猴头菌(hericium erinaceus(bull.)pers.)是一种食药两用菌，又名猴头蘑、刺猬菌、猴头、菜花菌。多生长在深山密林中许多阔叶树像壳斗科和胡桃科树木的腐木和立木的受伤处。‘沪猴8号’系上海市农业科学院食用菌研究所经工厂化系统筛选的猴头菌菌株0605和刺长为亲本，通过原生质体单杂交选育，产量较高，菇型较好，等鲜浓度值(euc)提高了40％。该品种2017年通过上海市种子管理总站认定，命名为‘沪猴8号’。

2、近年来，随着分子生物学技术的快速发展，多重pcr扩增技术因其高效、准确、特异性强的特点，在菌种鉴别领域得到了广泛应用，通过设计针对特定菌种的多重pcr引物，可以同时扩增多个目标基因片段，进而通过测序等方法对菌种进行准确鉴定，针对猴头菌“沪猴8号”这一优良品种，本研究采用多重pcr扩增技术，结合mnp(单核苷酸多态性)标记基因型鉴定方法，对“沪猴8号”菌种进行了鉴别，该方法通过精心设计的引物，能够同时扩增“沪猴8号”菌种多个基因片段，并通过测序分析确定其mnp标记基因型，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，本方法具有准确性高、特异性强、可重复性好的优点。

3、在本研究中，通过收集我国17个猴头菌菌种，并对它们进行多重pcr扩增及mnp标记基因型鉴定，发现本方法能够准确鉴别出“沪猴8号”菌种，并且具有“沪猴8号”菌种的专一性，这一结果充分证明了本方法的有效性和可靠性，为“沪猴8号”菌种的鉴别提供了一种新的高效、准确的工具。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

3、一种猴头菌菌种的多重pcr扩增及其mnp标记基因型鉴定方法，该方法包括如下步骤：

4、(1)菌丝培养：将猴头菌菌丝转接到pda平板上，25℃下避光培养，15d后收集菌丝；

5、(2)基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为100～200ng/ul：

6、(3)多重pcr扩增：将mnp标记引物组内的10对引物等量混合后对上述提取的dna进行多重pcr扩增；

7、(4)测序：将上述多重pcr的产物加上illumina的测序接头和barcode并使用illumina测序仪进行测序。

8、(5)通过illumina测序仪的测序结果来进行mnp标记基因型鉴定。

9、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(3)中pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premix taqtm(1.25u/25μl taq dna酶，0.4mm/l dntp，0.3mm/lpcrbuffer)10ul，4μmol/lmnp标记引物组混合引物，ddh2o 4ul，浓度100～200ng/μl提取的模板dna2μl。

10、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(3)中pcr反应条件为：94℃初始变性5min；94℃变性45s，60℃退火5min，72℃延伸5min，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。

11、作为本发明的一种优选技术方案，所述10对mnp标记基因型组合为：gt005/gt005/gt008/gt008/gt007/gt004/gt004/gt006/gt004/gt005的菌种，确定该菌种为猴头菌‘沪猴8号’菌种。

12、作为本发明的一种优选技术方案，所述10对mnp标记引物组序列为seq id no.1～seq id no.20。

13、作为本发明的一种优选技术方案，所述菌株的mnp标记引物组，是利用猴头菌基因组多个连续核苷酸多态性开发的10对mnp标记引物的混合，对猴头菌菌种进行多重pcr扩增及基因型鉴定，将得到的基因型与‘沪猴8号’菌种的mnp基因型对照，与该mnp基因型一致即为猴头菌‘沪猴8号’菌种。

14、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(5)mnp标记基因型鉴定的具体操作如下：

15、①使用fastp软件过滤测序接头；

16、②使用bwa软件比对gca_009827175.1基因组，并使用samtools工具对sam文件排序并转成bam文件；

17、③使用bcftools进行变异检测；

18、④使用r包genehapr进行mnp标记基因型鉴定方法。

19、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

20、本发明的猴头菌‘沪猴8号’菌种的多重pcr扩增及其mnp标记基因型鉴定可用于‘沪猴8号’菌种的鉴别，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有准确性高、特异性强、可重复性好的优点，该方法在所收集的我国17个猴头菌菌种中具有‘沪猴8号’菌种的专一性的优点，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premix taqtm(1.25u/25μltaq dna酶，0.4mm/l dntp，0.3mm/lpcrbuffer)10ul，4μmol/lmnp标记引物组混合引物，ddh2o 4ul，浓度100～200ng/μl提取的模板dna 2μl。

3.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中pcr反应条件为：94℃初始变性5min；94℃变性45s，60℃退火5min，72℃延伸5min，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述10对mnp标记基因型组合为：gt005/gt005/gt008/gt008/gt007/gt004/gt004/gt006/gt004/gt005的菌种，确定该菌种为猴头菌‘沪猴8号’菌种。

5.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述10对mnp标记引物组序列为seq id no.1～seq id no.20。

6.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述菌株的mnp标记引物组，是利用猴头菌基因组多个连续核苷酸多态性开发的10对mnp标记引物的混合，对猴头菌菌种进行多重pcr扩增及基因型鉴定，将得到的基因型与‘沪猴8号’菌种的mnp基因型对照，与该mnp基因型一致即为猴头菌‘沪猴8号’菌种。

7.根据权利要求1所述的一种猴头菌沪猴8号菌株mnp标记的多重pcr扩增及其基因型鉴定方法，其特征在于，所述步骤(5)mnp标记基因型鉴定的具体操作如下：

技术总结
本发明公开了一种猴头菌沪猴8号菌株MNP标记的多重PCR扩增及其基因型鉴定方法，属于猴头菌菌种的检测领域，该引物组由10对基于猴头菌全基因组测序后开发的MNP标记引物组成，本发明的猴头菌‘沪猴8号’菌种MN P标记的多重PCR扩增及其基因型鉴定可用于猴头菌‘沪猴8号’菌种的特异性鉴定，具有准确性高、特异性强、可重复性好的优点，在收集的17个猴头菌菌种中猴头菌‘沪猴8号’菌种具有的专一性。

技术研发人员：李巧珍,杨焱,张忠,吴迪,李正鹏,于海龙
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23