一种单分子荧光抗体、制备方法及应用与流程

本发明属于抗体制备，具体涉及一种单分子荧光抗体、制备方法及应用。

背景技术：

1、流式细胞术是一种常用的细胞检测技术，主要是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞悬液进行多参数、快速分析或分选，从而实现对细胞表面蛋白、胞内蛋白、dna或rna等成分的分析。抗体是流式细胞术检测的重要工具，通过抗体与细胞标志物的特异结合从而识别不同类型的细胞，将抗体跟荧光分子连在一起，用于信号的检测，常用的荧光分子包括异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)等。目前，抗体与荧光蛋白分子的结合方式多为化学偶联，但在化学偶联的过程中会出现荧光分子标记不均一的问题，即：单个抗体分子上所连接的荧光分子个数不同；此外，在进行化学标记的过程中还可能会影响抗体与靶标分子的结合活性以及抗体本身的稳定性，导致检测灵敏度降低。为提高细胞检测的灵敏度和特异性，需要将抗体与荧光分子的定点定量标记，而传统的化学标记方法难以实现这个目标，因此需要开发新的解决方案。

2、此外，完整的抗体分子由可变区和恒定区组成，可变区用于识别靶标分子，恒定区用于与fc受体结合发挥效应。在对细胞进行流式检测的过程中，不仅抗体的可变区可以与靶标分子特异结合，抗体的恒定区也可以与表达fc受体的细胞结合，导致检测结果出现假阳性。为解决这一问题，需要在检测前加入fc阻断剂来阻断抗体恒定区与表达fc受体的细胞的结合，同时还需要加入同型对照抗体组作为对照组，导致实验过程复杂繁琐。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种单分子荧光抗体、制备方法及应用。该单分子荧光抗体通过将抗体片段的可变区与荧光蛋白分子通过特定的接头序列连接，实现了抗体与荧光蛋白分子的定点、定量标记，在使用该单分子荧光抗体对细胞进行检测时，获得了更好的灵敏度和特异性；且使用该单分子荧光抗体可以避免fc阻断剂的使用，简化了检测流程。

2、为解决以上技术问题，本发明的第一方面提供一种单分子荧光抗体，包括融合表达的抗体可变区序列和荧光蛋白序列；其中，所述抗体可变区序列与荧光蛋白序列通过一接头序列连接，所述接头序列的基因序列如seq id no.1所示；所述单分子荧光抗体不包括抗体恒定区序列。

3、本发明提供的单分子荧光抗体，通过将抗体可变区序列与荧光蛋白序列通过特定的接头序列seq id no.1连接，不仅实现了抗体可变区与荧光蛋白之间的定点、定量标记，还使所得单分子荧光抗体具有更高的检测灵敏度和特异性，发明人推测，这是由于所选择的接头序列seq id no.1能够同时与抗体可变区序列和荧光蛋白序列发生最大程度的“匹配”，进而减少了接头序列的引入对抗体本身稳定性的影响。而且，该单分子荧光抗体仅表达抗体中与抗原结合的可变区，避免了因抗体的恒定区与表达fc受体细胞的结合导致流式细胞检测结果出现假阳性而不得不使用fc阻断剂的问题，大大简化了检测流程。

4、结合第一方面，所述抗体可变区序列由重链可变区和轻链可变区通过一短的柔性肽连接成一scfv形式，其中，所述柔性肽序列为ggsggsggsggsgg。

5、结合第一方面，所述抗体可变区序列和荧光蛋白序列融合表达的融合蛋白分子通过hek-293细胞或cho细胞重组表达。

6、结合第一方面，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

7、本发明的第二方面提供一种上述单分子荧光抗体的制备方法，步骤包括：将所述抗体可变区序列和荧光蛋白序列通过如seq id no.1所示的接头序列连接，通过细胞重组表达后、纯化，获得抗体-荧光蛋白融合分子，命名为单分子荧光抗体。

8、本发明提供的单分子荧光抗体的制备方法步骤简单，易于操作，有利于产业化生产。

9、结合第二方面，选择hek-293细胞或cho细胞作为重组表达的转染细胞。

10、本发明的第三方面提供一种上述单分子荧光抗体在细胞检测中的应用。

11、本发明的第六方面提供一种蛋白冻干粉，所述蛋白冻干粉由上述单分子荧光抗体经冷冻干燥工艺制得。现有的荧光抗体一般应在2～8℃保存，且不能在-20℃冻存，而本发明提供的单分子荧光抗体可采用冷冻干燥工艺制成蛋白冻干粉，并可在-20℃保存1年之久。

12、本发明提供的单分子荧光抗体与偶联法得到的荧光抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性，适用于不同类型的流式细胞检测，且使用该单分子荧光抗体的细胞检测实验流程简单，无需额外使用fc阻断剂，也无需增加同型对照抗体处理组，提高了检测效率。

技术特征：

1.一种单分子荧光抗体，其特征在于，包括融合表达的抗体可变区序列和荧光蛋白序列；

2.如权利要求1所述的单分子荧光抗体，其特征在于，所述抗体可变区序列由重链可变区和轻链可变区通过一短的柔性肽连接成一scfv形式，其中，所述柔性肽序列为ggsggsggsggsgg。

3.如权利要求1～2任一项所述的单分子荧光抗体，其特征在于，所述抗体可变区序列和荧光蛋白序列融合表达的融合蛋白分子通过hek-293细胞或cho细胞重组表达。

4.如权利要求1所述的单分子荧光抗体，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

5.一种权利要求1～4任一项所述的单分子荧光抗体的制备方法，其特征在于，步骤包括：

6.如权利要求5所述的单分子荧光抗体的制备方法，其特征在于，选择hek-293细胞或cho细胞作为重组表达的转染细胞。

7.一种权利要求1～4任一项所述的单分子荧光抗体在细胞检测中的应用。

8.一种蛋白冻干粉，其特征在于，所述蛋白冻干粉由权利要求1～4任一项所述的单分子荧光抗体经冷冻干燥工艺制得。

技术总结
本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种单分子荧光抗体、制备方法及应用。本发明提供一种单分子荧光抗体，包括融合表达的抗体可变区序列和荧光蛋白序列；其中，所述抗体可变区序列与荧光蛋白序列通过一接头序列连接，所述接头序列的基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述单分子荧光抗体不包括抗体恒定区序列。本发明提供的单分子荧光抗体与偶联法得到的荧光抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性，适用于不同类型的流式细胞检测，且使用该单分子荧光抗体的细胞检测实验流程简单，无需额外使用Fc阻断剂，也无需增加同型对照抗体处理组，大大提高了检测效率。

技术研发人员：张军方
受保护的技术使用者：深圳市因诺赛生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31