一种测定发酵酶液中磷脂酶D酶活的方法与流程

本发明属于磷脂酶，具体涉及一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法。

背景技术：

1、磷脂酶d(phospho l i pase d，pld)是一类能够水解磷脂分子中磷酸酯键的酶类，广泛存在于动植物和微生物中。其酶活性具有重要的生物学意义，涉及多种细胞信号转导过程和生物活性物质的生成。随着生物技术的快速发展，磷脂酶d的酶活研究日益受到关注。磷脂酶d能够催化磷脂分子中磷酸酯键的水解，生成磷脂酸和相应的醇类。这一反应过程在生物体内具有多种生理功能，如参与细胞膜磷脂的重塑、信号转导、囊泡运输等。在医学领域，磷脂酶d的酶活性与多种疾病的发生和发展密切相关。例如，在癌症细胞中，磷脂酶d的酶活性异常升高，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。因此，研究磷脂酶d的酶活性对于揭示癌症的发病机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。此外，磷脂酶d的酶活性也在神经生物学和免疫学等领域发挥重要作用。在神经系统中，磷脂酶d参与神经递质的释放和突触可塑性等过程，对于神经系统的正常功能至关重要。在免疫系统中，磷脂酶d参与炎症反应和免疫细胞的活化等过程，对于维持机体免疫平衡具有重要意义。因此，深入研究磷脂酶d的酶活性及其调控机制，不仅有助于理解磷脂酶d在生物体内的生理功能，也有助于为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效、准确测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法。

2、本发明的上述目的是通过如下技术手段来实现的：

3、将磷脂溶于水，加入含磷脂酶d的发酵液和酶激活剂进行酶活反应，随后加入灭酶剂终止反应，反应液减压干燥，浓缩物用高效液相-蒸发光检测器检测，测定被转化的磷脂酰胆碱和生成的磷脂酸的量，通过公式计算出磷脂酶d的酶活。

4、本发明所述磷脂原料来源包括但不限于大豆磷脂、葵花磷脂、花生磷脂、菜籽油磷脂、蛋黄磷脂，磷脂中磷脂酰胆碱的含量为20～60％按质量体积百分数计算，按质量体积比计算，磷脂与水的比例为1:2～1:10。

5、本发明所述的磷脂与含磷脂酶d的发酵液比例，按质量体积百分数计算，质量体积比为1:(0.5～4)。

6、本发明所述酶激活剂，为氯化钙、硫酸镁中的一种，按质量百分比计算，酶激活剂添加量为磷脂的0.1～3.0％。

7、本发明所述酶活反应的温度为25-45℃。

8、本发明所述酶活反应时间为5～30min。

9、本发明所述终止反应的灭酶剂为甲醇、乙醇中的一种，按体积百分比计算，灭酶剂添加量与反应水量加酶液量总和的比例为3:1～5:1。

10、本发明所述加入灭酶剂终止反应的时间为为5～30min

11、本发明所述高效液相-蒸发光检测方法为：(1)甲醇为定溶剂，色谱柱为硅胶柱；(2)流动相a为：正己烷：异丙醇：乙酸＝465:475:10，流动相b为：异丙醇：水：乙酸＝855:145:10，梯度洗脱；(3)洗脱条件为：0～8min：5％～34％b；8～12min：34％～40％b；12～14.5min：40％～100％b；14.5～15.5min；100％～5％b；15.5～20min：95％b；(4)流速：0.8ml/min,进样量：15μl,检测器漂移管温度：80℃,气体流速,3.0l/min；柱温：42℃；(5)以磷脂酸和磷脂酰胆碱标准品为外标物，外标法计算大豆磷脂净转化率。

12、本发明所述磷脂酰胆碱平均分子量为758da，即1μmo l磷脂酰胆碱重量约为0.758mg；磷脂酸平均分子量为697da，即1μmo l磷脂酰胆碱重量约为0.697mg。

13、本发明所述磷脂酶d的酶活定义为：每分钟将1μmo l磷脂酰胆碱(pc)完全转化需要的酶液量(ml)。

14、本发明所述磷脂酶d酶活计算公式为：酶活(i u)＝酶液量×反应时间/被转化的磷脂酰胆碱的量。其中被转化的磷脂酰胆碱量单位为μmo l，反应时间单位为min，酶液量单位为ml。例如：10ml酶液在10min内转化了50μmo l磷脂酰胆碱，那么该酶液的酶活为2i u。

15、本发明所述被转化的磷脂酰胆碱量计算公式为：被转化的磷脂酰胆碱量(μmo l)＝初始磷脂酰胆碱量(μmo l)-酶活反应后剩余的磷脂酰胆碱量(μmo l)。

16、本发明所述酶活反应后剩余的磷脂酰胆碱量通过高效液相-蒸发光检测方法检测，以磷脂酰胆碱标准品为外标物，外标法计算获得。计算公式为：酶活反应后剩余的磷脂酰胆碱量(μmo l)＝(样品峰面积-截距)*样品重量*10/斜率/758。其中截距和斜率通过外标物绘制标准曲线获得，重量单位为g，758为磷脂酰胆碱的分子量，10为换算系数。

17、本发明所述酶活反应生成的磷脂酸(pa)的量通过高效液相-蒸发光检测方法检测，以磷脂酸标准品为外标物，外标法计算获得。计算公式为：生成的磷脂酸量(μmo l)＝(样品峰面积-截距)*样品重量*10/斜率/697。其中截距和斜率通过外标物绘制标准曲线获得，重量单位为g，697为磷脂酸的分子量，10为换算系数。

18、本发明用于验证酶活结果的定义为：1ml酶活为1i u的酶液1分钟能转化1μmo l磷脂酰胆碱。计算公式为：被转化的磷脂酰胆碱＝酶液量×反应时间/酶活。其中被转化的磷脂酰胆碱量单位为μmo l，反应时间单位为min，酶液量单位为ml。

19、与本发明所述的磷脂酶d酶活的测定方法相比，现有的磷脂酶d酶活测定是通过磷脂酶(pc)催化磷脂酰胆碱(pc)合成磷脂酰丝氨酸(ps)的方法，其反应机理是磷脂酶d先将pc催化水解为磷脂酰基和胆碱，然后磷脂酰基再与丝氨酸结合生成ps，这一过程存在两个风险:(1)磷脂酰基于丝氨酸结合不完全；(2)生成的ps被磷脂酶d再次水解变回磷脂酰基和丝氨酸。磷脂酰基为不稳定物质，没有物质与之连接很快会进一步分解成为更稳定的磷脂酸(pa)。因而通过pc转化为ps的方法测定磷脂酶d酶活反应的条件非常苛刻，容错率极低。

20、本发明通过测定磷脂酶d催化磷脂酰胆碱(pc)水解生成磷脂酸(pa)的方法测定磷脂酶d的酶活，由于磷脂酸(pa)是磷脂酶d作用于磷脂酰胆碱(pc)的最终产物，与现有将磷脂酰胆碱转化为磷脂酰丝氨酸(ps)的检测方法相比，操作更为简单、迅速，容错率更高，检测结果更为准确。

技术特征：

1.一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于：将磷脂溶于水，加入含磷脂酶d的发酵液和酶激活剂进行酶活反应，随后加入灭酶剂终止反应，反应液减压干燥，浓缩物用高效液相-蒸发光检测器检测，测定被转化的磷脂酰胆碱和生成的磷脂酸的量，通过公式计算出磷脂酶d的酶活，酶活计算公式为：酶活＝酶液量×反应时间/被转化的磷脂酰胆碱的量，其中被转化的磷脂酰胆碱量单位为μmol，反应时间单位为min，酶液量单位为ml。

2.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，按质量百分数计算，所述磷脂来源包括大豆磷脂、葵花磷脂、花生磷脂、菜籽油磷脂和蛋黄磷脂中的任意一种，磷脂中磷脂酰胆碱的含量为20～60％，按质量体积比，磷脂与水的比例为1:2～1:10。

3.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，按质量体积比计算，磷脂水溶液与含酶发酵液的比例为1:0.5～1:4。

4.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，添加的酶激活剂为氯化钙、氯化镁、硫酸镁中的一种，按质量百分比计算，酶激活剂添加量为磷脂的0.1～3.0％。

5.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，所述酶活反应的温度为25～45℃。

6.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，所述酶活反应的时间为5～30min。

7.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，终止反应的灭酶剂为甲醇、乙醇中的一种，按体积百分比计算，灭酶剂添加量与反应水量加酶液量总和的比例为3:1～5:1。

8.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，加入灭酶剂终止反应的时间为5～30min。

9.根据权利要求1所述的一种测定发酵酶液中磷脂酶d酶活的方法，其特征在于，采用高效液相-蒸发光检测，检测方法为：(1)甲醇为定溶剂，色谱柱为硅胶柱；(2)流动相a为：正己烷：异丙醇：乙酸＝465:475:10，流动相b为：异丙醇：水：乙酸＝855:145:10，梯度洗脱；(3)洗脱条件为：0～8min：5％～34％b；8～12min：34％～40％b；12～14.5min：40％～100％b；14.5～15.5min；100％～5％b；15.5～20min：95％b；(4)流速：0.8ml/min,进样量：15μl,检测器漂移管温度：80℃,气体流速,3.0l/min；柱温：42℃；(5)以磷脂酸和磷脂酰胆碱标准品为外标物，外标法计算被转化的磷脂酰胆碱和生成的磷脂酸含量。

技术总结
本发明公开了一种测定发酵酶液中磷脂酶D酶活的方法。包含将磷脂溶于水，加入含磷脂酶D的发酵液和酶激活剂进行反应，随后加入灭酶剂终止反应，反应液减压干燥，浓缩物用高效液相‑蒸发光检测器检测，外标法定量，测定磷脂酰胆碱和磷脂酸含量，通过公式计算出磷脂酶D的酶活。本发明可以快速、高效测定磷脂酶D酶活。

技术研发人员：林杰,李令星,车日晖,陈少华,黄文燕
受保护的技术使用者：翁源广业清怡食品科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/29