杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记及应用

本发明涉及分子标记，具体涉及一种杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记及应用。

背景技术：

1、我国食用菌产业发展迅速，总产量从1986年的50万吨，猛增至2022年的4222.54万吨，总产值增长至4102.7亿元，成为食用菌第一生产大国和出口大国。在大规模食用菌栽培中，子实体释放的大量担孢子会引起各种各样的问题，最严重的是从业工人由于吸入孢子而引起的过敏性肺泡炎（也称“蘑菇肺”）。此外，会引起的其他问题包括：降低食用菌商业价值，破坏栽培设施，传播病毒性疾病，减少野外相同栽培种类自然种群的遗传多样性等。因此，为了有效预防过量孢子所带来的各种问题，无孢或少孢菌株的获得一直是食用菌育种工作的一个主要方向。

2、自发突变产生的无孢菌株较少，现在所知的大部分食用菌无孢或少孢菌株都是通过单孢杂交或诱变获得的。目前，只有柱状田头菇 cyclocybe aegerita、糙皮侧耳 pleurotus ostreatus和杏鲍菇 pleurotus eryngii具有能进行商业种植应用的无孢菌种，而多数无孢或少孢菌株因为产量太低难以应用于商业化栽培。近些年来，随着基因组学、生物信息学、分子生物学等学科的迅猛发展和技术进步，多学科的深度交叉融合催生育种技术进入分子水平。食用菌的分子标记辅助育种以及转基因育种实践已经陆续开展，已在双孢蘑菇 agaricus bisporus、白灵侧耳 pleurotus tuoliensis等多种食用菌中进行了成功探索。因此，研究影响担孢子形成的相关基因， 可为无孢分子育种提供理论依据。

3、在前期的研究中，通过单核菌株交配在野生型食用菌杨柳田头菇 agrocybe  salicacicola 菌株中获得了孢子缺陷型菌株。本研究通过 bsa-seq 基因定位，进一步定位杨柳田头菇中可能参与孢子发育的基因，探索杨柳田头菇无孢突变的分子机制，为研究杨柳田头菇及其他食用菌的生殖遗传、无孢分子育种提供理论支持。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记以解决背景技术中存在的问题，具体的本发明提供以下技术方案：

2、一种杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记，所述分子标记序列为seq id no: 1所示的序列。

3、在一些实施方案中，本发明一种扩增所述分子标记的引物对。本领域技术人员公知，可以借助多种现有技术工具进行目的序列扩增引物对的设计，如snapgene、primerpremier、oligo calc、 lamp designer等工具进行引物对设计，不同引物对只要能实现扩增本发明所述分子标记80%以上，包括但不限于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%均在本发明的保护范围内。

4、在一个具体的实施方式中，所述引物对为seq id no: 2和seq id no: 3所示的序列。

5、在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒含检测权所述分子标记的试剂。

6、在一个实施方式中，一种基因芯片，所述基因芯片含检测所述分子标记的引物对。

7、进一步的，本发明提出所述的分子标记，或所述的引物对，或所述的试剂盒，或所述的基因芯片在下述a1）～ a10）任一种中的应用：

8、a1）在杨柳田头菇遗传多样性分析中的应用；

9、a2）在杨柳田头菇品种多样性分析中的应用；

10、a3）在杨柳田头菇亲缘关系分析中的应用；

11、a4）在杨柳田头菇品种鉴定中的应用；

12、a5）在构建杨柳田头菇遗传图谱或dna指纹图谱中的应用；

13、a6）在杨柳田头菇种质资源改良中的应用；

14、a7）在杨柳田头菇基因定位或功能基因挖掘中的应用；

15、a8）在杨柳田头菇分子标记辅助育种中的应用；

16、a9）在杨柳田头菇基因编辑育种中的应用。

17、在一种实施方案中，本发明提出一种杨柳田头菇是否产担孢子的鉴定方法，包括以下步骤：

18、（1）提取待测杨柳田头菇的基因组dna；

19、（2）以提取的待测杨柳田头菇的基因组dna为扩增模板，以所述的引物对进行pcr扩增；

20、（3）对扩增后的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果未出现seq id no:1所示的序列片段，则待测杨柳田头菇为无孢杨柳田头菇，不产担孢子；反之则为产担孢子杨柳田头菇。

21、优选的，pcr扩增反应体系选用50 µl体系，其中2×taq plus master mix ⅱ 25µl、正向引物2µl、反向引物2µl、dna模板1 µl、ddh2o 20 µl。

22、优选的，pcr扩增程序采用95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72℃延伸5min，重复30个循环后，72 ℃终延伸10 min。

23、本发明达到的技术效果：

24、本发明基于bsa混池测序分析开发鉴定杨柳田头菇是否产生担孢子的特异dna分子标记，并基于特异性分子标记的序列信息设计出相应的检测引物，本发明可以经济、快速、准确、灵敏的区分出待测单核菌株与无孢单核菌株杂交后形成的子实体成熟后是否能产生担孢子，为杨柳田头菇的无孢分子育种提供技术支持。

技术特征：

1.一种杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记，其特征在于，所述分子标记序列为seqid no: 1所示的序列。

2.一种扩增权利要求1所述分子标记的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对为seq id no: 2和seq idno: 3所示的序列。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含检测权利要求1所述分子标记的试剂。

5.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片含权利要求2或3所述的引物对。

6.权利要求1所述的分子标记，或权利要求2-3任一所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5所述的基因芯片在下述a1）～ a9）任一中的应用：

7.一种杨柳田头菇是否产担孢子的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，pcr扩增反应体系选用50 µl体系，其中2×taq plus master mix ⅱ 25 µl、正向引物2 µl、反向引物2 µl、dna模板1 µl、ddh2o 20 µl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，pcr扩增程序采用95 ℃预变性3 min，95℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸5min，重复30个循环后，72 ℃终延伸10 min。

技术总结
本发明涉及分子标记技术领域，具体公开一种杨柳田头菇担孢子缺失关联分子标记及应用，所述分子标记序列为SEQ ID NO:1所示的序列，本发明提供的特异性分子标记序列可以经济、快速、准确、灵敏的区分出待测单核菌株与无孢单核菌株杂交后形成的子实体成熟后是否能产生担孢子，为杨柳田头菇的无孢分子育种提供技术支持。

技术研发人员：陶南,陈卫民,赵永昌,刘萍,柴红梅,马渊浩
受保护的技术使用者：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/2