一种PP2A和EIF5A作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用。

背景技术：

1、水飞蓟(silybum marianum(l.)gaertn.)又名水飞雉、奶蓟等，属于菊科水飞蓟属草本植物，入药部位为种子(果实)，是多国药典收载的天然药物，临床上主要用于治疗肝炎、脂肪肝、肝硬化、缺血性损伤、辐射损伤等。水飞蓟素为菊科植物水飞蓟的果实或种子的总提取物，含65％-80％黄酮木脂素(或称水飞蓟素混合物)，20％-35％脂肪酸，少量黄酮和一些多酚，其有效成分为黄酮木脂素类化合物，由水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁等成分组成。

2、水飞蓟宾是水飞蓟素中含量最高的成分，系由一分子的黄杉素(toxifolin)和一分子的松柏醇(coniferylalcohol)耦合而成，属于类黄酮(flavonoid)物质中的异黄酮类(isoflavone)。目前虽然对于水飞蓟宾的纯化方法、化学性质及生理活性等已经进行了大量而深入的研究，但关于于水飞蓟宾的生物合成途径及调控机理的研究却十分有限。

3、内参基因的高稳定性有助于基因表达数据的可靠性。理想的内参基因应该在不同的组织器官、不同的生长发育期等条件下均能表现稳定的表达趋势。筛选合适的内参基因是获得可靠qrt-pcr分析结果的前提。目前还未有文献报导对于水飞蓟果实不同发育期及不同组织内参基因的筛选。

4、qrt-pcr是对dna、rna(mrna、mirna与non-coding rna)样品进行定量和定性分析的一项重要技术。其中，相对定量法利用内参基因的表达量作为标准能简单、准确且高效地检测目的基因的相对表达量。物种的差异决定了基因在不同物种中的表达趋势具有差异性，同一物种不同组织器官及不同发育阶段中相同基因的表达也存在差异。理想情况下，内参基因的表达水平不受任何内源或外源性因素的影响。迄今为止，尚未有研究发现普遍适用于所有条件的理想内参基因。因此，针对不同物种的不同实验所研究的不同组织、基因型、发育阶段和处理条件，都需要寻找适合其实验体系的内参基因。

5、因此，对水飞蓟的稳定内参基因及其引物的开发，在水飞蓟分子生物学研究及其药效成分生物合成的研究中皆具有重要实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用，为水飞蓟不同组织条件下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用。

4、优选的，扩增所述pp2a基因的上游引物如seq id no.1所示，上游引物序列如seqid no.2所示；扩增所述eif5a基因的上游引物如seq id no.3所示，上游引物序列如seq idno.4所示。

5、优选的，所述不同水飞蓟组织为水飞蓟的茎、叶、花和不同发育期果实

6、本发明还提供了一种不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

7、(1)取水飞蓟植株上的茎、叶、花和不同发育期的果实，液氮冷冻，并提取总rna；

8、(2)将步骤(1)提取的总rna反转录得到cdna；

9、(3)使用9个候选rg的引物制作各自的标准曲线，并计算对应引物的扩增效率、每个基因ct均值，然后使用9个候选rg的引物进行qrt-pcr扩增，并检测9个候选rg的扩增效率、ct均值及每对引物的相关系数；

10、(4)根据得到的扩增效率、ct均值及每对引物的相关系数，利用δct、genorm、normfinder、bestkeeper四种统计分析方法，分析内参基因的稳定性；最后利用reffinder工具对所有内参基因的表达稳定性进行综合排序，筛选出最适合的内参基因。

11、优选的，所述9个候选rg分别为：18s、ubq2、tua5、adf、elf5a-1、pp2a、mir172a、mir319a、mir396。

12、本发明还提供了一种检测水飞蓟药效成分生物合成情况的荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：

13、(1)取水飞蓟植株上的茎、叶、花和不同发育期的果实，液氮冷冻，并提取总rna；

14、(2)将步骤(1)提取的总rna反转录得到cdna；

15、(3)使用扩增pp2a和eif5a内参基因的引物seq id no.1～seq id no.4扩增步骤(2)得到的cdna，并对扩增结果进行分析得到水飞蓟果实发育阶段药效成分生物合成情况。

16、本发明与现有技术相比的有益效果为：

17、(1)本发明通过4种算法(genorm、normfinder、bestkeeper和reffinder)评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于水飞蓟不同组织和果实不同发育期的荧光定量内参基因pp2a和eif5a；

18、(2)本发明设计了内参基因pp2a和eif5a的实时荧光定量pcr引物，该引物特异性强，扩增效率高，为水飞蓟不同组织条件下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础。

技术特征：

1.pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用。

2.根据权利要求1所述pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用，其特征在于，扩增所述pp2a基因的上游引物如seq id no.1所示，下游引物序列如seq idno.2所示；扩增所述eif5a基因的上游引物如seq id no.3所示，下游引物序列如seq idno.4所示。

3.根据权利要求1所述pp2a和eif5a作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述不同水飞蓟组织为水飞蓟的茎、叶、花和不同发育期果实。

4.一种不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的筛选方法，其特征在于，所述9个候选rg分别为：18s、ubq2、tua5、adf、elf5a、pp2a、mir172a、mir319a、mir396。

6.一种检测水飞蓟药效成分生物合成情况的荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种PP2A和EIF5A作为不同水飞蓟组织荧光定量内参基因的应用，属于生物技术领域。本发明通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder这4种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于水飞蓟不同组织和果实不同发育期的荧光定量内参基因PP2A和EIF5A。本发明设计了内参基因PP2A和EIF5A的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，为水飞蓟不同组织条件下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础。

技术研发人员：严梓铷,何秋伶,赵予婕,徐伯衡
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/29