用于检测白色念珠菌的引物探针组合及其试剂和试剂盒的制作方法

本发明涉及生物基因，尤其涉及用于检测白色念珠菌的引物探针组合及其试剂和试剂盒。

背景技术：

1、假丝酵母菌，俗称念珠菌，本属菌有150多种，其中有11种对人有致病性，其中以白假丝酵母菌为最常见的致病菌。超过95％的ic由以下5种病原菌引起：白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，其中，白色念珠菌是ic患者最常见的病原菌，占50％-70％。耳念珠菌，是日本2009年发现的一种新病原真菌物种，具有多重耐药、高致死率、易于传播以及鉴定困难等特征，被冠以“超级真菌”的称号。

2、目前真菌传统的检测方法采用如直接镜检、培养及血清学检测等，敏感性及特异性不高，检出率低，报告周期长，难以用于早期检测。全自动微生物鉴定系统能实现上百种病原真菌的准确鉴定，操作简单，相对于培养等方法快速(6个小时左右)，但存在设备耗材价格昂贵等缺点。近年来发展起来的质谱方法也面临设备昂贵问题，同时通量低，无法做到大量样本同时检测。

技术实现思路

1、本发明提供用于检测白色念珠菌的引物探针组合及其试剂和试剂盒，以解决检测样本是否存在白色念珠菌的问题。

2、本发明提供的用于检测白色念珠菌的引物探针组合，包括：组合1；

3、所述组合1包括：引物组1和探针1；所述引物组1的两项引物序列分别为：如seq idno:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；所述探针1的序列为：如seq id no:37所示的核苷酸序列。

4、进一步，本发明所述的引物探针组合，还包括：内标引物组和内标探针；

5、所述内标引物组的两项引物序列分别为：如seq id no:55和seq id no:56所示的核苷酸序列；

6、所述内标探针的序列为：如seq id no:57所示的核苷酸序列。

7、本发明提供的试剂盒，包括：如本发明所述的引物探针组合。

8、进一步，本发明所述的试剂盒，所述引物探针组合采用冻干球。

9、进一步，本发明所述的试剂盒，所述试剂盒的盒体结构包括：本体、盖体、底座和阀体；所述盖体、所述本体和所述底座依次顺序连接，在所述本体内部穿设有所述阀体；

10、所述本体底部朝向所述盖体的一侧设有若干个试剂腔，所述本体底部朝向所述底座的一侧设有阀体活动腔，所述本体的中心设有中空柱状结构的阀体腔，所述本体的侧壁设有反应腔；

11、所述阀体包括：相互固定连接的柱体和流道切换机构；所述柱体设于所述阀体腔内，所述流道切换机构设于所述阀体活动腔内，所述柱体可在所述阀体腔内沿所述阀体腔的周向旋转，所述流道切换机构可在所述阀体活动腔内同步旋转；

12、所述流道切换机构设有处理腔；所述处理腔内设有生物体过滤机构；所述处理腔还设有输液口；所述试剂腔和所述反应腔分别设有导通部件；通过沿周向旋转所述流道切换机构，使所述输液口分别与所述试剂腔或所述反应腔的导通部件对齐导通，以使所述试剂腔或所述反应腔分别与所述处理腔相连通；

13、所述柱体包括：柱塞腔和柱塞；所述柱塞腔为中空贯通结构，与所述处理腔相连通，所述柱塞设于所述柱塞腔内并且所述柱塞在所述柱塞腔内可以沿所述柱塞腔的轴向活动。

14、进一步，本发明所述的试剂盒，所述盖体包括：上盖和与所述上盖相连接的下盖；

15、所述上盖设有中心柱，所述下盖设有与所述中心柱相配合的中心孔，所述中心柱与所述中心孔环绕在轴心周围，所述中心柱插入所述中心孔以构成与所述柱塞腔同轴连通的柱塞孔，所述柱塞穿设于所述柱塞孔和所述柱塞腔内；

16、所述下盖上设有凸台，所述上盖上设有与所述凸台相配合的环筋，所述凸台与所述环筋环绕所述盖体内部空间的外周，所述凸台与所述环筋相配合以使所述上盖和所述下盖之间密封；

17、其中，所述中心柱与所述中心孔之间设有第一密封机构；所述凸台与所述环筋之间设有第二密封机构。

18、进一步，本发明所述的试剂盒，所述下盖上设有与所述试剂腔对应的的第一透气孔；

19、所述上盖设有第二透气孔；

20、所述上盖与所述下盖之间设有气体过滤机构。

21、进一步，本发明所述的试剂盒，所述凸台外围围设密封膜并且所述密封膜覆盖在第一透气孔上。

22、本发明提供的用于检测白色念珠菌的引物探针组合及其试剂和试剂盒，特异性强、灵敏度高，最低检测限可以达到1cfu/pcr反应，整体检测时间进一步缩短至1.5小时以内。

23、本发明使用保守性好且多拷贝的非its区域作为靶标，采用分子信标探针熔解曲线的方法，并且通过添加内源性内标，对pcr过程进行实时监控。

24、本发明的检测试剂直接封装在多孔位卡盒中，配套扩增反应系统一体机进行检测，实现样本进结果出，整个流程封闭设计，操作简便，完全避免气溶胶污染。

技术特征：

1.用于检测白色念珠菌的引物探针组合，其特征在于，包括：组合1；

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括：内标引物组和内标探针；

3.试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1或2所述的引物探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合或者所述引物探针试剂采用冻干球。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的盒体结构包括：本体、盖体、底座和阀体；所述盖体、所述本体和所述底座依次顺序连接，在所述本体内部穿设有所述阀体；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述盖体包括：上盖和与所述上盖相连接的下盖；

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述下盖上设有与所述试剂腔对应的的第一透气孔；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述凸台外围围设密封膜并且所述密封膜覆盖在第一透气孔上。

技术总结
本发明提供的用于检测白色念珠菌的引物探针组合及其试剂和试剂盒，特异性强、灵敏度高，最低检测限可以达到1CFU/PCR反应，整体检测时间进一步缩短至1.5小时以内。本发明提供的试剂盒，将进行念珠菌检测所需的各项处理试剂放置入盒体的试剂腔内，通过控制盒体内的阀体运动，将各项处理试剂与待测样本按照预设顺序混合处理后送入盒体的反应腔。一方面避免了操作人员重复机械地进行试剂混合流程，能更加便捷地进行后续的扩增反应，另一方面避免人为污染引起实验结果出现假阳性或假阴性问题。

技术研发人员：张淼,柳丽萍,郭求真
受保护的技术使用者：鲲鹏基因（北京）科学仪器有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/24