本发明属于细胞模型构建，具体涉及呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法。
背景技术：
1、产仔数是母猪繁殖性能的重要指标之一，直接影响养猪业经济效益。猪妊娠期胚胎死亡率高达30%-50%，其中大部分的妊娠失败发生在胚胎附植期。因此猪妊娠早期的胚胎附植是影响母猪产仔数的关键环节。在猪胚胎附植过程中，需要滋养层细胞的增殖和迁移等过程，从而使得胚胎与子宫建立组织及生理联系。因此，胎盘滋养层细胞附着到子宫内膜是胚胎成功着床的关键，直接影响胚胎附植和产仔数。
2、呕吐毒素，学名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, don），能引起大多数动物中毒，其中猪是对don最易感的家畜之一。don可造成猪拒食、生长抑制、呕吐以及器官损伤、细胞毒性、免疫毒性等毒害作用。don可抑制母猪子宫细胞增殖，阻碍卵母细胞和胚胎发育。另外，霉变玉米中的don导致仔猪卵巢组织抗氧化水平降低。此外，don可以诱导猪卵巢颗粒细胞的形态变化和凋亡，并抑制细胞增殖。并且，don能够导致公猪睾丸支持细胞结构破坏、细胞周期停滞和氧化应激。关于don对猪胎盘滋养层细胞的影响，目前尚无公开报道。
3、现有技术（戴超辉, 李辉, 赵为民,等. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对猪毒害作用及毒理机制研究进展[j]. 畜牧兽医学报, 2023,54(01): 24-35.）提及到don对肝细胞、脾细胞、肠细胞、卵母细胞、睾丸细胞等的毒害作用，但并未涉及到don对猪胎盘滋养层（ptr）细胞的影响。鉴于妊娠早期胚胎附植对产仔数的重要影响，而胎盘滋养层细胞又直接决定胚胎附植的效率，本发明旨在通过探究don的不同剂量、不同侵染时间对ptr细胞的毒理作用，建立don侵染猪胎盘滋养层细胞的病理模型，将对进一步研究don对猪繁殖毒性和病理研究提供非常重要的实验材料和技术方法。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是提供一种呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，优化了构建呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型的条件，包括don的浓度和处理细胞的时间，将对进一步研究don对猪繁殖毒性和病理研究提供非常重要的实验材料和技术方法。
2、为解决上述技术问题，本发明的实施例提供呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，包括以下步骤：
3、步骤一、将ptr细胞接种至96孔板，更换培养基，加入don诱导细胞，浓度设定为：0、0.5 μg/ml、1 μg/ml和2μg/ml；时间设定为：24 h、48 h和72 h后；处理结束后每孔加入10 μl的cck-8溶液，在37 ℃下恒温孵育2 h，用酶标仪检测在450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率，筛选出抑制ptr细胞活力的don浓度剂量和诱导时间；
4、步骤二、将ptr细胞接种至12孔板，加入don诱导细胞，浓度设定为：0、0.5μg/ml、1μg/ml和2μg/ml；时间设定为：24 h、48 h和72 h，处理结束后收集细胞总rna，反转录成cdna；利用2-δδct方法计算基因的相对表达水平，以
gapdh的表达作为内参来标准化基因表达水平，筛选出引起ptr细胞增殖抑制、氧化应激和迁移抑制的don浓度剂量和诱导时间；
5、步骤三、利用步骤二中12孔板培养ptr细胞，待细胞密度达90%后，用10μl枪头垂直于培养板底面画线制造划痕，分别在0 h、24 h、48 h和72 h处统计各组细胞的划痕宽度，验证ptr细胞在不同dod浓度下细胞的迁移能力的差异，得到don诱导ptr细胞损伤的细胞模型。
6、其中，步骤一中所述ptr细胞在试验前进行优化处理：将ptr细胞接种至含10%胎牛血清的dmem/f12培养液中，置于含5%co2的37 ℃恒温培养箱培养，长满后消化传代。
7、其中，步骤二中，所述基因表达水平表现于针对
ccnd1、
cdk4、
sod1、
cat和
cemip为目的基因分别对0、0.5 μg/ml、1 μg/ml和2 μg/ml浓度下don诱导ptr细胞进行目的基因表达水平检测，并以
gapdh为内参对目的基因的表达进行均一化。
8、其中，步骤三中，计算细胞划痕愈合率采用以下公式：
9、细胞划痕愈合率(%) =［（t0时划痕宽度值-tt时划痕宽度值）/t0时划痕宽度值］×100。
10、本发明上述技术方案的有益效果如下：
11、本发明优化了构建呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型的条件，包括don的浓度和处理细胞的时间，以don诱导ptr细胞通过cck-8检测细胞存活率，以不同浓度don诱导ptr细胞针对
ccnd1、
cdk4、
sod1、
cat和
cemip为目的基因利用2-δδct方法计算基因的相对表达水平，并以细胞划痕实验检测ptr细胞迁移能力，将don对ptr细胞的毒性表现在ptr细胞活力抑制、增殖抑制、迁移抑制和抗氧化能力，最终确定呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建的最佳条件为0.5μg/ml的don处理ptr细胞48 h，将对进一步研究don对猪繁殖毒性和病理研究提供非常重要的实验材料和技术方法。
技术特征：1.呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，其特征在于，步骤一中所述ptr细胞在试验前进行优化处理：将ptr细胞接种至含10%胎牛血清的dmem/f12培养液中，置于含5%co2的37 ℃恒温培养箱培养，长满后消化传代。
3.根据权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，其特征在于，步骤二中，所述基因表达水平表现于针对ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip为目的基因分别对0、0.5 μg/ml、1 μg/ml和2 μg/ml浓度下don诱导ptr细胞进行目的基因表达水平检测，并以gapdh为内参对目的基因的表达进行均一化。
4.根据权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，其特征在于，步骤三中，计算细胞划痕愈合率采用以下公式：
技术总结本发明公开了呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，优化了构建呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型的条件，包括DON的浓度和处理细胞的时间，将对进一步研究DON对猪繁殖毒性和病理研究提供非常重要的实验材料和技术方法。
技术研发人员：戴超辉,程金花,孔明华,李辉,赵为民,付言峰,李碧侠,王学敏,廖超,陈彦羽
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：技术公布日：2024/9/26