一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的PCR-RFLP法

本发明涉及病毒检测领域，特别是涉及一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法。

背景技术：

1、小鹅瘟是由鹅细小病毒(goose parvovirus，gpv)引起雏鹅的一种急性、高度接触性、败血性传染病，该病毒能通过种蛋、精液等将病毒传播给下一代，生产中常发生野毒株隐性带毒。为预防小鹅瘟病毒感染，最有效的方式是注射高免卵黄抗体或疫苗免疫，目前市面的小鹅瘟疫苗获得了10个批文，均为减毒活疫苗，毒株分别为syg26-35、syg41-50和gd株。其中两个批文疫苗使用syg26-35、syg41-50株，其余8个批文疫苗均使用gd株。虽减毒活疫苗毒力减弱，但仍具有复制能力，也存在排毒和毒力返强的风险，常规的血清学、pcr法或荧光pcr法无法区分野毒隐性感染和疫苗株病毒复制，因此生产中急需一种灵敏高效的检测手段，区分活疫苗复制还是野毒隐性感染，用于种鹅场gpv检测、净化，活疫苗散毒风险评估等，保障群体健康。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法。本方法的特异性强、适用性广、灵敏度高，能区分市面上仅有的3株活疫苗株syg26-35、syg41-50、gd株和绝大多数gpv野毒株，包括经典gpv、番鸭细小病毒和新型小鹅瘟病毒毒株。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法根据gpv疫苗株相较于与野毒株，包括如下：根据gpv疫苗株相较于与野毒株，在rep基因上发生了特异的单碱基突变t<c，形成了一个回文序列acatgt，包含一个pcii酶切位点，针对该区域设计一对特异性pcr扩增引物，进行pcr扩增，扩增片段经pcii限制性内切酶切后，疫苗株扩增片段被切割成两条带，而野毒株不被切割，形成单一条带。

3、优选地，该gpv疫苗株为syg26-35、syg41-50、gd株。

4、优选地，gpv疫苗株相较于与野毒株序列，位于非结构蛋白rep基因上存在一个c/t的多态性，该位点在所有的疫苗株上为c，在野毒株上为t。

5、优选地，所述特异性pcr扩增引物设计要求：引物结合部位的序列保守性较高，即使在不同疫苗株和野毒株间存在个别碱基突变，但不能为引物结合位置的3’端，保证能同时扩增不同的gpv疫苗株和野毒株，并要求引物的上下游与突变位点的距离存在差异，保证经酶切后能通过琼脂糖凝胶电泳区分大小。

6、优选地，所述特异性pcr扩增引物为：

7、gpv-rep-f3：ctgtgcggctgggtgaag；

8、gpv-rep-r3：cgttcgggttctctgtctgg，

9、最适退火温度为55℃，pcr扩增后形成大小为1088bp单一条带。

10、优选地，扩增片段只有1个pcii限制性酶切位点。

11、优选地，所述疫苗株扩增片段被pcii限制性酶切割，琼脂糖凝胶电泳后检测到大小为324bp和764bp的两条片段，野毒株pcr片段不被切割，琼脂糖凝胶电泳后检测到大小为1088bp的一条片段。

12、优选地，pcii限制性酶切pcr片段的最优酶用量为1iu，切割100ng，最适酶切温度为37℃，最适反应时间为1h，切割100ngpcr产物，最适酶切温度为37℃，最适反应时间为1h。。

13、本发明的优点：

14、本方法合成一对特异性的引物，扩增gpv的rep基因的一个片段，该片段上存在一个gpv疫苗株和野毒株特异性的单碱基多态性，该位点在疫苗株上形成了一个回文序列acatgt，产生了pcii的酶切位点，使用pcii限制酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测，疫苗株能被切割成两个片段，而野毒株不被切割，形成单一条带，该方法为gpv病原鉴定、种鹅场gpv净化、疫苗株散毒风险评估、小鹅瘟无疫区建设提供可靠的工具。本方法的特异性强、适用性广、灵敏度高，能区分市面上仅有的3株活疫苗株syg26-35、syg41-50、gd株和绝大多数gpv野毒株，包括经典gpv、番鸭细小病毒和新型小鹅瘟病毒。

技术特征：

1.一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于，包括如下：根据gpv疫苗株相较于与野毒株，在rep基因上发生了特异的单碱基突变t<c，形成了一个回文序列acatgt，包含一个pcii酶切位点，针对该区域设计一对特异性引物，进行pcr扩增，扩增片段经pcii限制性内切酶切割后，疫苗株扩增片段被切割成两条带，而野毒株不被切割，形成单一条带。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

4.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

5.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

6.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：扩增片段只有1个pcii限制性酶切位点。

7.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：所述疫苗株扩增片段被pcii限制性酶切割，琼脂糖凝胶电泳后检测到大小为324bp和764bp的两条片段，野毒株pcr片段不被切割，琼脂糖凝胶电泳后检测到大小为1088bp的一条片段。

8.根据权利要求1所述的一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：pcii限制性酶切pcr片段的最优酶用量为1iu，切割100ng，最适酶切温度为37℃，最适反应时间为1h，切割100ngpcr产物，最适酶切温度为37℃，最适反应时间为1h。

技术总结
本发明公开了一种鉴别小鹅瘟病毒减毒活疫苗株与野毒株的PCR‑RFLP法，涉及病毒检测领域，本发明的技术方案比较GPV疫苗株和野毒株病毒基因组，疫苗株在Rep基因上发生了一个特异性的T<C碱基突变，产生了一个PciI酶切位点，针对该位点区域设计一对特异性引物，进行PCR扩增，扩增片段经PciI限制性内切酶切割，疫苗株扩增片段被切割成两条带，而野毒株不被切割，形成单一条带。本方法能区分市面上仅有的3株活疫苗株SYG26‑35、SYG41‑50、GD株和绝大多数GPV野毒株，特异性强、适用性广、灵敏度高，为GPV病原学研究、疫病净化、活疫苗散毒风险评估和无疫标准化养殖场建设等提供可靠的检测工具。

技术研发人员：张克山,高广亮,王雪玫,王启贵,陈主平,钟航,王珍,李来旭,何信群
受保护的技术使用者：重庆市畜牧科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/10/10