一种涕灭威半抗原、抗原、抗体及涕灭威检测试纸条和应用的制作方法

本发明属于免疫学，具体涉及的是一种涕灭威半抗原、抗原、抗体及涕灭威检测试纸条和应用。

背景技术：

1、涕灭威属于氨基甲酸酯类农药，是20世纪40年代发现并发展起来的，具有选择性强、高效、广谱、低毒、易分解、残毒少等优点，已被广泛用于农业、林业、畜牧等领域。该农药一般为白色结晶粉末，难溶于水，易溶于有机溶剂，遇碱即可分解，受光线和温度等作用可降解。因涕灭威半衰期短，故对食品污染相对较轻。涕灭威进入人体后，可抑制胆碱酯酶的活性，会导致人体出现流涎、流泪、颤动、瞳孔缩小等症状。对中度较低的中毒者有短暂的麻醉性，而大剂量的中毒者则会出现严重的麻痹，并伴随严重的呼吸困难。国际癌症研究机构在2007年把涕灭威列为2a类致癌物。根据我国农业部门有关禁限用农药的有关规定，我国已明令禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类、中草药材上等作物使用涕灭威。2021年发布实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(gb2763—2021)标准中规定涕灭威在果蔬中的最大残留限量为0.02-0.1mg/kg，2020年版《中华人民共和国药典》中规定板蓝根等药用植物中的最大残留限量为0.1mg/kg。

2、目前，涕灭威检测方法主要为仪器检测和酶联免疫分析法(elisa)。仪器检测常用的包括气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法等，具有很高的灵敏度和特异性，但仍存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备，时间长以及熟练的技术人员。elisa是将抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一、敏感性相结合的一种标记免疫学技术。但是elisa方法存在以下缺点：(1)elisa法检测一般需要3-4h才能出结果，检测时限长；(2)elisa由于加样量不一致，加样时间长短不一，洗涤条件，操作人员不一致，会导致测定重复差值大，重复性差；(3)elisa法检测时需要使用多种仪器设备或试剂操作步骤相对复杂，需经过相关实验仪器培训的人员操作；(4)elisa法制作成本高，制作耗材、使用样本量、试剂用量及试剂种类等相对较多且价格昂贵；(5)elisa法的储运温度2-8℃，要求较高；(6)elisa加样相对复杂，容易发生孔间污染，从而导致假阳性结果，影响测试的准确性。

3、基于上述方法存在的缺点，胶体金免疫层析法因其测试时间短、准确度好、重复性好、操作简单、成本低等优点得到广泛应用。胶体金免疫分析技术(cgia)是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫分析技术，胶体金具有很大的比表面积及良好的生物相容性，可以与被标记物通过物理吸附进行非共价结合，其标记技术具有简单快速和无污染等优点，且结果检测不需昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至通过肉眼即可辨别鉴定。凭借以上优点，基于胶体金的检测技术一度成为研究的热点，尤其是胶体金免疫层析试纸条已被广泛使用。但是，如何提高检测结果的精确度和降低其检测限值是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的：针对现有检测涕灭威的技术的不足和缺陷，提供一种快速检测涕灭威的金标层析试纸条的制备方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测中药材中涕灭威残留，具体如下：

2、本发明的第一方面，主要提供一种涕灭威半抗原，所述的涕灭威半抗原结构式如式(ⅰ)所示：

3、

4、本发明的第二方面，主要提供一种涕灭威抗原，由所述的涕灭威半抗原与载体蛋白偶联得到。

5、优选的，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种或几种。

6、本发明的第三方面，提供所述的涕灭威半抗原或所述的涕灭威抗原在以下任一方面的应用：

7、(1)制备涕灭威抗体；

8、(2)制备涕灭威检测试剂；

9、(3)制备涕灭威检测试纸条；

10、(4)制备涕灭威检测试剂盒。

11、本发明的第四方面，提供一株分泌涕灭威单克隆抗体的杂交瘤细胞株bxmd，所述杂交瘤细胞株bxmd于2024年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45913。

12、本发明的第五方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株bxmd分泌制备。

13、本发明的第六方面，提供一种涕灭威检测试纸条，所述的试纸条包括衬板、样品垫、包被膜和吸水垫，所述的样品垫、包被膜和吸水垫依次设置于衬板上，所述的包被膜上平行设置有检测线和对照线，所述的检测线上包被有所述的涕灭威抗原，所述的对照线上包被有羊抗鼠igg。

14、优选的，所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；所述的样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚二氟乙烯膜、或聚酯膜；所述的包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧化纤维素膜；所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。

15、优选的，所述的包被膜上设置有两条检测线。

16、优选的，所述的试纸条还包括配套使用的96微孔板，所述96微孔板上包被有标记物。

17、优选的，所述的标记物为胶体金或胶体硒标记的涕灭威单克隆抗体，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株bxmd分泌制备，所述杂交瘤细胞株bxmd于2024年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45913。

18、本发明的第七方面，提供所述的涕灭威检测试纸条在以下任一方面的应用：

19、(1)制备涕灭威检测试剂盒；

20、(2)制备涕灭威检测装置；

21、(3)检测涕灭威。

22、本发明的有益效果：

23、(1)本发明提供了一种涕灭威半抗原，所述的涕灭威半抗原是发明人自行研发，并委托合成公司合成得到，所述的半抗原可用于制备涕灭威抗原，涕灭威抗体以及检测试剂；

24、(2)本发明另提供了一种涕灭威抗原，所述的涕灭威抗原是由所述的涕灭威半抗原与载体蛋白偶联得到，所述的涕灭威抗原可以用于制备涕灭威抗体和涕灭威检测试剂；

25、(3)本发明还提供了一株分泌涕灭威单克隆抗体的杂交瘤细胞株bxmd，所述的细胞株是由涕灭威抗原免疫动物获得，可以用于制备涕灭威抗体；

26、(4)本发明还提供了涕灭威单克隆抗体，所述的涕灭威单克隆抗体由杂交瘤细胞株bxmd分泌获得。

27、(5)本发明还提供了一种涕灭威检测试纸条，所述的试纸条具有特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到3.152ng/ml；还具有简便、快速、时效性强，使用胶体金层析检测试纸条，无需任何其它大型仪器可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在10min内即可判定检测结果。能更加快速、灵敏、简便地检测中药材中涕灭威残留；结果判定形象、直观、准确，简单明了；不易出现假阳性和假阴性等人为误判；节省费用，适用范围广，便于推广；具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

技术特征：

1.一种涕灭威半抗原，其特征在于，所述的涕灭威半抗原结构式如式(ⅰ)所示：

2.一种涕灭威抗原，其特征在于，由权利要求1所述的涕灭威半抗原与载体蛋白偶联得到。

3.如权利要求2所述的涕灭威抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的涕灭威半抗原或权利要求2所述的涕灭威抗原在以下任一方面的应用：

5.一株分泌涕灭威单克隆抗体的杂交瘤细胞株bxmd，其特征在于，所述杂交瘤细胞株bxmd于2024年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45913。

6.一种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由权利要求5所述的杂交瘤细胞株bxmd分泌制备。

7.一种涕灭威检测试纸条，所述的试纸条包括衬板、样品垫、包被膜和吸水垫，所述的样品垫、包被膜和吸水垫依次设置于衬板上，其特征在于，所述的包被膜上设置有检测线和对照线，所述的检测线上包被有权利要求2所述的涕灭威抗原，所述的对照线上包被有羊抗鼠igg。

8.如权利要求7所述的涕灭威检测试纸条，其特征在于，所述的试纸条还包括配套使用的96微孔板，所述96微孔板上包被有标记物。

9.如权利要求8所述的涕灭威检测试纸条，其特征在于，所述的标记物为胶体金或胶体硒标记的涕灭威单克隆抗体，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株bxmd分泌制备，所述杂交瘤细胞株bxmd于2024年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45913。

10.如权利要求6-9任一项所述的涕灭威检测试纸条在以下任一方面的应用：

技术总结
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及的是一种涕灭威半抗原、抗原、抗体及涕灭威检测试纸条和应用，涕灭威半抗原结构式如式(Ⅰ)所示，可用于制备涕灭威抗原，涕灭威抗体以及检测试剂；提供了一种涕灭威抗原，由涕灭威半抗原与载体蛋白偶联得到，可用于制备涕灭威抗体和涕灭威检测试剂；还提供了一株分泌涕灭威单克隆抗体的杂交瘤细胞株BXMD，可以用于制备涕灭威抗体；还提供了一种涕灭威检测试纸条，所述的试纸条具有特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到3.152ng/mL；还具有简便、快速、时效性强，使用胶体金层析检测试纸条，无需任何其它大型仪器可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在10min内即可判定检测结果；

技术研发人员：邱国玉,张政,王小芳,朱永红,杨树栋,杨俊良,胡九禄,甄世伟,裴璐,汉佳昕
受保护的技术使用者：甘肃药业集团国方检验检测有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10