一种鉴定铁皮石斛的分子标记SH6、方法和试剂盒

本发明涉及生物，具体涉及一种鉴定铁皮石斛的分子标记sh6、方法和试剂盒。

背景技术：

1、铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生型草本植物,是我国常用的传统中药材。铁皮石斛具有极高的药用价值，因此市场需求量大，但其生长规律以及野生资源的破坏使得产量不足,因而价格昂贵。市场存在利用外观相似、性质相近的细茎石斛或曲茎石斛等来充当铁皮石斛原料进行加工和售卖的现象，严重影响了铁皮石斛市场的健康发展，损害了消费者合法权益。

2、我国兰科石斛属植物有74种2变种，是中药中最复杂的一类药材之一，经过多位专家学者近几十年的努力，《中国药典》中的石斛条目逐步清晰，在收录石斛条目时也会给予注明“近似种”字样，实际上是将所有石斛属植物均涵盖在内，这就容易造成石斛属植物被大量采挖。同时“近似种”这一描述，实际上是未明确区分各种石斛种质资源的，铁皮石斛dna条形码以及分子标记的开发，为铁皮石斛种质鉴定提供了新动力。

3、dna条形码鉴定技术以及分子标记的应用大幅提高了鉴定的效率和鉴定的准确性。前人已分别在不同石斛matk、trn h-psb a、ycf5基因片段和its序列上开发了相应标记用于鉴定铁皮石斛及其他石斛，并构建了dna条形码，但其区分的石斛有限。叶绿体基因组包含丰富的遗传信息，被广泛用于物种鉴定及系统进化研究，铁皮石斛与其“近似种”叶绿体基因组上的差异片段成为鉴定标记开发的靶标。因此，基于叶绿体基因组dna开发一种分子标记，构建其条形码，应用于鉴定铁皮石斛及其“近似种”，对实现石斛属种质资源的鉴定、应用和保存具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种鉴定铁皮石斛的分子标记sh6、方法和试剂盒。本发明提供的分子标记可以特异性区分铁皮石斛及其“近似种”石斛，可在中药干品状态下准确鉴定铁皮石斛及其“近似种。

2、本发明的技术方案：

3、一种鉴定铁皮石斛的分子标记sh6，所述分子标记sh6由上游引物sh6f和下游引物sh6r组成；

4、所述上游引物sh6-f的核苷酸序列：5'-aagattctatcctagaac-3'；

5、所述下游引物sh6-r的核苷酸序列：5'-ttgaaccgatgacttacg-3'。

6、一种鉴定铁皮石斛的方法，是利用前述的分子标记sh6对石斛基因组进行扩增测序或电泳检测。

7、前述扩增测序按照以下步骤进行：

8、(1)使用植物dna提取试剂盒提取待测石斛样品的基因组dna；

9、(2)利用前述的分子标记sh6对待测石斛样品的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

10、(3)对pcr扩增产物进行测序，得到dna序列，与ncbi基因组数据库进行比对，得到鉴定结果。

11、前述步骤(3)中，pcr扩增的体系由50ng/μl石斛基因组dna 0.2μl，pcr mastermix 9μl，10μm上游引物0.4μl，10μm下游引物0.4μl和无菌去离子水10μl组成。

12、前述步骤(3)中，pcr扩增的条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，47℃退火20秒，72℃延伸30秒，38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

13、前述电泳检测按照以下步骤进行：

14、s1：使用植物dna提取试剂盒提取待测石斛样品的基因组dna；

15、s2：利用前述的分子标记sh6对待测石斛样品的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

16、s3：将所述扩增产物取5μl点样在琼脂糖凝胶上，电泳保持在180v的恒压下15min后拍照。

17、前述步骤s3中，所诉琼脂糖凝胶的质量体积百分比浓度为1.5％。

18、一种鉴定铁皮石斛的试剂盒，包括前述的分子标记sh6，所述分子标记sh6由上游引物sh6f和下游引物sh6r组成；

19、所述上游引物sh6-f的核苷酸序列：5'-aagattctatcctagaac-3'；

20、所述下游引物sh6-r的核苷酸序列：5'-ttgaaccgatgacttacg-3'。

21、前述试剂盒的pcr扩增反应体系由50ng/μl石斛基因组dna 0.2μl，pcr mastermix 9μl，10μm上游引物0.4μl，10μm下游引物0.4μl和无菌去离子水10μl组成。

22、前述试剂盒的pcr扩增的条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，47℃退火20秒，72℃延伸30秒，38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

23、有益效果

24、本发明通过特异性引物的pcr扩增，可以在琼脂糖凝胶电泳图中直接观察铁皮石斛及其“近似种”的扩增片段。铁皮石斛的扩增目的片段为545bp，其他石斛的扩增片段均大于545bp。将扩增产物测序后可鉴定铁皮石斛及其“近似种”。根据测序比对结果还可建立铁皮石斛及其“近似种”的dna条形码。本发明提供的鉴别方法不仅能够快速准确鉴别铁皮石斛药材，还能鉴定其他至少13种石斛，通过电泳法检测，只需4h就能完成，准确率达到80％以上，而通过扩增测序法检测，2天内能完成，但准确率能达到100％。分子标记sh6制备的试剂盒，其方法简单，特异性好，用时短，仅20μl就能完成。

技术特征：

1.一种鉴定铁皮石斛的分子标记sh6，其特征在于，所述分子标记sh6由上游引物sh6f和下游引物sh6r组成；

2.一种鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的分子标记sh6对石斛基因组进行扩增测序或电泳检测。

3.根据权利要求2所述的鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于：所述扩增测序按照以下步骤进行：

4.根据权利要求3所述的鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，pcr扩增的体系由50ng/μl石斛基因组dna 0.2μl，pcr master mix 9μl，10μm上游引物0.4μl，10μm下游引物0.4μl和无菌去离子水10μl组成。

5.根据权利要求3所述的鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，pcr扩增的条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，47℃退火20秒，72℃延伸30秒，38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

6.根据权利要求2所述的鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于：所述电泳检测按照以下步骤进行：

7.根据权利要求6所述的鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于：所述步骤s3中，所诉琼脂糖凝胶的质量体积百分比浓度为1.5％。

8.一种鉴定铁皮石斛的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括权利要求1所述的分子标记sh6，所述分子标记sh6由上游引物sh6f和下游引物sh6r组成；

9.根据权利要求8所述的鉴定铁皮石斛的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的pcr扩增反应体系由50ng/μl石斛基因组dna 0.2μl，pcr master mix 9μl，10μm上游引物0.4μl，10μm下游引物0.4μl和无菌去离子水10μl组成。

10.根据权利要求8所述的鉴定铁皮石斛的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的pcr扩增的条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，47℃退火20秒，72℃延伸30秒，38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

技术总结
本发明公开了一种鉴定铁皮石斛的分子标记SH6、方法和试剂盒。所述分子标记SH6由上游引物SH6F和下游引物SH6R组成；所述上游引物SH6‑F的核苷酸序列：5'‑AAGATTCTATCCTAGAAC‑3'；所述下游引物SH6‑R的核苷酸序列：5'‑TTGAACCGATGACTTACG‑3'。本发明通过分子标记SH6对石斛基因组进行扩增测序或电泳检测，铁皮石斛的扩增目的片段为545bp，其他石斛的扩增片段均大于545bp，以鉴定铁皮石斛及其“近似种”。分子标记SH6制备的试剂盒，其方法简单，特异性好，用时短，仅20μL就能完成。

技术研发人员：聂琼,李沁芸,杨倩,韦丽娇
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31