基于TlmPV的扩增性病毒样颗粒及其制备方法和应用与流程

本申请涉及生物基因，尤其涉及一种基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、将目标基因安全、稳定、高效的递送到靶细胞对于转化医学非常重要，例如传染病预防、基因治疗、再生医学和基因功能研究等。然而将候选目的基因递送到靶细胞仍然存在许多障碍，目前已经探索了许多基于病毒和非病毒载体系统的策略用于基因递送，但各有缺点，所以安全、高效、多功能且易于生产的基因递送系统亟待被开发。

2、病毒样颗粒（virus⁃like particles，vlp）是组装成病毒衣壳天然形状的蛋白质，病毒样颗粒与真实病毒的构象极其相似，其模仿真实病毒颗粒的蛋白质，但其内不含病毒复制所需要的核酸，无感染能力，但仍具免疫原性；不存在病毒未完全灭活、病毒基因组交换重组、病毒返祖等潜在风险。病毒结构蛋白可以在各种活体或无细胞的表达系统中进行组装和重建成类病毒结构。

3、病毒样颗粒虽安全性与有效性得到了广泛认同，但vlp的合成具有生产工艺复杂、生产成本较高、纯化和分离困难等缺点，仍需进一步改进。因此兼顾vlp载体在人体内的安全性与大规模生产的竞争力，仍然是需要解决的问题。

4、而利用副粘病毒的特性，通过分子克隆技术开发具有初次感染性，可以在靶细胞中表达外来基因而不产生后代的扩增病毒样颗粒（amplifying-vlp, avlp）。具有初次感染性的扩增病毒样颗粒将携带外源基因在宿主细胞内完成蛋白表达与vlp组装，将弥补传统vlp工艺开发与成本控制的缺点。

技术实现思路

1、本申请实施例提供一种基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，以解决相关技术存在的问题，技术方案如下：

2、第一方面，本申请实施例提供了基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，由tl8k-avlp核苷酸与表达m蛋白、f蛋白、tm蛋白、g蛋白的质粒组合转染细胞产生；

3、所述tl8k-avlp核苷酸包括tlmpv tl8k 病毒基因；其中tl8k病毒基因全部m、f、sh、tm和g基因被完全除去，并被可表达外源基因的核苷酸序列替换。

4、在一种实施方式中，其中可表达外源基因的核苷酸序列插入在除去全部m、f、sh、tm和g基因的tl8k病毒基因的p和l基因之间。

5、在一种实施方式中，所述可表达外源基因的核苷酸序列包括neo基因与sars-cov-2 s基因。

6、在一种实施方式中，所述tlmpv tl8k 病毒为野生型tlmpv tl8k 病毒。

7、在一种实施方式中，tl8k-avlp核苷酸连接在puc19载体上。

8、在一种实施方式中，tl8k-avlp核苷酸与表达 n 蛋白、p 蛋白、l蛋白、t7 聚合酶的辅助质粒组合转染细胞获得稳定细胞系。

9、在一种实施方式中，所述基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒具有如seq id no.1所示核苷酸序列。

10、第二方面，本申请实施例提供了一种基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

11、将tlmpv病毒野生型tl8k株基因组中m、f、tm、g基因敲除；插入可表达外源基因的核苷酸序列，获得重组基因；

12、重组基因连接到puc19载体，与表达 n 蛋白、p 蛋白、l蛋白、t7 聚合酶的辅助质粒组合转染vero细胞获得avlp稳定细胞系；

13、avlp稳定细胞系共转染表达m蛋白、f蛋白、tm蛋白、g蛋白的质粒，得到所述基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒。

14、第三方面，本申请实施例提供了基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒在新型疫苗与基因递送系统中的应用。

15、第四方面，本申请实施例提供了基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒在制备传染病、肿瘤以及蛋白替换治疗药物中的应用。

16、上述技术方案中的优点或有益效果至少包括：

17、(1)本申请的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，基于tl8k病毒基因进行体外重组修饰与病毒包装，具有tm基因与较大g基因，其基因组容量远高于其他属副粘病毒；去除了m、f、sh、tm和g基因的重组tl8k-avlp病毒载体预期被改造成为具有携带更长外源基因潜能并稳定表达目的蛋白的新型基因递送系统。

18、(2)本申请的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒的应用，不含介导病毒与细胞融合、病毒出芽所需要的基因序列，因而扩增性病毒样颗粒不存在病毒基因组交换重组、病毒返祖等潜在风险。并且可以嵌合表达外源重组基因，并在各种系统中进行组装和重建成类病毒结构。因此该扩增病毒样颗粒有望发展成为传染病、肿瘤以及蛋白替换治疗等临床应用中具有竞争力的新型疫苗与基因递送系统。

19、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本申请进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。

技术特征：

1.基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

5.根据权利要求1所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

6.根据权利要求1所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

7.根据权利要求1-6任一项所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒，其特征在于，

8.一种基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.权利要求1-8任一项所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒在新型疫苗与基因递送系统中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的基于tlmpv的扩增性病毒样颗粒在制备传染病、肿瘤以及蛋白替换治疗药物中的应用。

技术总结
本申请提出一种基于TlmPV的扩增性病毒样颗粒及其制备方法和应用，将TlmPV病毒野生型Tl8k株基因重组为Tl8k‑AVLP病毒载体，与PIV5不同具有TM基因和较大G基因，基因组容量远高于其他属副粘病毒。因此去除了M、F、SH、TM和G基因的重组Tl8k‑AVLP病毒载体具有携带更长外源基因潜能并稳定表达目的蛋白的新型基因递送系统。

技术研发人员：周琪,艾智武,康海仙,周璐,方裕丹,侯琛,张雅茹
受保护的技术使用者：广州思安信生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17