一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、阴沟肠杆菌复合体(enterobacter cloacae complex，ecc)是肠杆菌属中多个兼性厌氧革兰氏阴性菌种的集合体，自然存在于哺乳动物的肠道微生物组中，也是医院环境中最常见的病原体之一。其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、肺炎、尿路感染和败血症等感染有关，ecc感染占医疗环境中所有肠杆菌感染的65％-75％。随着头孢菌素的广泛使用，ecc已成为医院感染越来越重要的病原菌ecc能产生超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶，导致对第三代、第四代头孢菌素耐药，给临床治疗带来了难题。

2、这些病原体的标准诊断方法，主要是培养，通常因其在各种条件下(如细菌计数低、近期使用抗生素或样本稀释)易出现假阴性而受到限制。此外，培养物虽然信息丰富，但耗时且易受污染。与此同时，由于这些致病菌的毒力、发生率和流行率都不相同，例如，阴沟肠杆菌最常见于院内感染和社区感染，而通过培养的方法难以直接对其一一区分。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术问题，本发明的目的在于提供一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物、试剂盒及检测方法。

2、本发明提供一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物，所述组合物包括组分a、组分b、组分c、组分d、组分e中的至少一种；

3、所述组分a包括：引物对seq id no:1～2，探针seq id no:3；所述组分a检测阴沟肠杆菌；

4、所述组分b包括：引物对seq id no:4～5，探针seq id no:6；所述组分b检测阿氏肠杆菌；

5、所述组分c包括：引物对seq id no:7～8，探针seq id no:9；所述组分c检测霍氏肠杆菌；

6、所述组分d包括：引物对seq id no:10～11，探针seq id no:12；所述组分d检测神户肠杆菌；

7、所述组分e包括：引物对seq id no:13～14，探针seq id no:15；所述组分e检测路氏肠杆菌。

8、本发明采用实时荧光定量pcr技术，通过对检测阴沟肠杆菌复合体的上游引物、下游引物及对应探针的精心设计，提供的检测阴沟肠杆菌复合体的组合物能够实现对阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌、路氏肠杆菌中的至少一种的检测与区分，更适用于早期检测，具有较高的灵敏度、特异性以及精密度，能准确快速地检测阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌、路氏肠杆菌，提高检测效率、缩短检测周期，提供排除不同病原体感染的依据。

9、优选地，所述组合物包括所述组分a、所述组分b、所述组分c、所述组分d和所述组分e。

10、本方案所述组合物包括所述组分a、所述组分b、所述组分c、所述组分d和所述组分e，可同时实现对阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌和路氏肠杆菌联检和区分，不存在非特异扩增，整体检测效果好。

11、优选地，所述组分a、所述组分b、所述组分c、所述组分d和所述组分e中探针上均标记有荧光报告基团且彼此之间互不相同且互不干扰。

12、优选地，所述荧光报告基团包括fam、hex、rox、cy5或quasar 705中的一种。

13、优选地，所述组合物的各组分以混合的形式存在。

14、本发明提供一种检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，所述试剂盒包括所述检测阴沟肠杆菌复合体的组合物。

15、优选地，在每个反应体系中，每对所述引物对的浓度均为0.05μm～1μm，每个所述探针的浓度均为0.05μm～1μm。

16、进一步优选地，在每个反应体系中，每对所述引物对的浓度均为0.2μm，每个所述探针的浓度均为0.1μm。

17、优选地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dna聚合酶、udg酶、核糖核酸酶抑制剂、dntp(u)s、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

18、优选地，在每个反应体系中，所述dna聚合酶的浓度为0.1u/μl～1u/μl，mg2+的浓度为1mm～25mm，dntp(u)s的浓度为20μm-500μm。

19、进一步优选地，在每个反应体系中，所述dna聚合酶的浓度为0.29u/μl，mg2+的浓度为6mm，dntp(u)s的浓度为120μm。

20、优选地，所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品中的至少一种。

21、本发明还提供一种用于非诊断目的检测阴沟肠杆菌复合体的方法，包括如下步骤：

22、s1、提取待测样本的核酸，得到核酸样本；

23、s2、使用所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒对所述核酸样本进行pcr扩增；

24、s3、获得并分析结果。

技术特征：

1.一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物，其特征在于，所述组合物包括组分a、组分b、组分c、组分d、组分e中的至少一种；

2.根据权利要求1所述检测阴沟肠杆菌复合体的组合物，其特征在于，所述组合物包括所述组分a、所述组分b、所述组分c、所述组分d和所述组分e。

3.根据权利要求2所述检测阴沟肠杆菌复合体的组合物，其特征在于，所述组分a、所述组分b、所述组分c、所述组分d和所述组分e中探针上均标记有荧光报告基团且彼此之间互不相同且互不干扰。

4.根据权利要求3所述检测阴沟肠杆菌复合体的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团包括fam、hex、rox、cy5或quasar 705中的一种。

5.一种检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～4任一项所述检测阴沟肠杆菌复合体的组合物。

6.根据权利要求5所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，其特征在于，在每个反应体系中，每对所述引物对的浓度均为0.05μm～1μm，每个所述探针的浓度均为0.05μm～1μm。

7.根据权利要求5所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dna聚合酶、udg酶、核糖核酸酶抑制剂、dntp(u)s、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

8.根据权利要求7所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，其特征在于，在每个反应体系中，所述dna聚合酶的浓度为0.1u/μl～1u/μl，mg2+的浓度为1mm～25mm，dntp(u)s的浓度为20μm-500μm。

9.根据权利要求5所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒，其特征在于，所述检测阴沟肠杆菌复合体的试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品中的至少一种。

10.一种用于非诊断目的检测阴沟肠杆菌复合体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种检测阴沟肠杆菌复合体的组合物、试剂盒及检测方法，组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E中的至少一种；组分A包括引物对SEQ ID NO:1～2，探针SEQ ID NO:3；组分B包括引物对SEQ ID NO:4～5，探针SEQ ID NO:6；组分C包括引物对SEQ ID NO:7～8，探针SEQ ID NO:9；组分D包括引物对SEQ ID NO:10～11，探针SEQ ID NO:12；组分E包括引物对SEQ ID NO:13～14，探针SEQ ID NO:15。本发明采用实时荧光定量PCR技术，提供检测阴沟肠杆菌复合体的组合物能够实现对阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌、路氏肠杆菌中的至少一种的检测与区分，具有较高的灵敏度、特异性以及精密度，能准确快速地检测阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌、路氏肠杆菌，提高检测效率、缩短检测周期。

技术研发人员：罗磊,刘佩珊,任小梅,吴康,戴立忠
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/10