一种白星姬小蜂线粒体CYTB基因及其应用和检测白星姬小蜂的方法

本发明属于昆虫分类和分子生物学，具体涉及一种白星姬小蜂线粒体cytb基因及其应用和检测白星姬小蜂的方法。

背景技术：

1、柑橘潜叶蛾(phyllocnistis citrella)属鳞翅目潜叶蛾科，为害柑、橘、橙、柚、柠檬、枸橼等所有柑橘属种类，主要部位是嫩梢、嫩枝和幼叶，幼虫钻入柑橘叶表皮内取食叶肉组织，形成弯曲的虫道，并在虫道中间留下排泄物，因此又名绘图虫和鬼画符。虫道干枯破裂后造成被害叶片卷缩，叶片光合效率下降且易脱落，叶片上的伤口还容易诱发柑橘溃疡病。柑橘潜叶蛾在柑橘产区均有分布发生，其防治主要依靠高效氯氟氰菊酯、阿维菌素、氯虫苯甲酰胺等化学药剂，但长期、大量使用化学药剂导致了柑橘果园天敌昆虫大量死亡等一系列问题，柑橘潜叶蛾的防治急需综合治理的方法。生物防治是一种无公害的防治技术，柑橘潜叶蛾运用生物防治的前提是搞清楚其寄生性天敌种类及寄生率。

2、柑橘潜叶蛾的优势寄生性天敌为白星姬小蜂(citrostichusphyllocnistoides)，白星姬小蜂寄生柑橘潜叶蛾2龄幼虫，已被多个国家引进并建立野外种群。明确寄生蜂对寄主的寄生率是进行生物防治的前提，目前关于白星姬小蜂对柑橘潜叶蛾的寄生情况调查主要是形态鉴定方法，一种是通过收集被柑橘潜叶蛾危害的叶片，观察是否有寄生蜂孵化出来，另一种是利用显微镜观察柑橘潜叶蛾幼虫虫体是否有寄生蜂若虫附着，但这两种方法存在实验周期长及不易观察等缺陷，因此，开发新的检测方法尤为必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种白星姬小蜂线粒体cytb基因及其应用和检测白星姬小蜂的方法，为白星姬小蜂的鉴定提供新的方法和思路，实现对白星姬小蜂的准确检测和鉴定，检测白星姬小蜂寄生率，辅助防治柑橘潜叶蛾。

2、本发明提供了一种白星姬小蜂线粒体cytb基因，所述线粒体cytb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述线粒体cytb基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列序列，所述下游引物包括如seq id no.3所示的核苷酸序列。

4、本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述线粒体cytb基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对。

5、本发明还提供了上述技术方案所述线粒体cytb基因或上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的试剂盒在检测和/或鉴定白星姬小蜂中的应用。

6、本发明还提供了一种检测白星姬小蜂的方法，包括以下步骤：

7、利用上述技术方案所述引物对对待测样本的dna进行扩增，得到扩增产物；

8、若所述扩增产物中含有365bp的条带，则所述待测样本中含有白星姬小蜂。

9、优选的，所述待测样本包括柑橘潜叶蛾和/或含有柑橘潜叶蛾的叶片。

10、优选的，所述扩增的体系为：10μmol/l上游引物1μl、10μmol/l下游引物1μl、pcr supermix 10μl、模板dna2μl，ddh2o 6μl。

11、优选的，所述扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

12、本发明还提供了上述技术方案所述cytb基因或上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的试剂盒或上述技术方案所述方法在辅助防治柑橘潜叶蛾中的应用。

13、本发明还提供了上述技术方案所述cytb基因或上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的试剂盒或上述技术方案所述方法在检测白星姬小蜂寄生率中的应用。

14、有益效果：

15、本发明提供的白星姬小蜂线粒体cytb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，该基因特异地存在于白星姬小蜂线粒体中，与柑橘潜叶蛾的线粒体基因具有明显差异，且易于扩增，因此能够用于白星姬小蜂的分子生物学鉴定，弥补了利用形态鉴定的不足，为白星姬小蜂的鉴定提供了新的方法和思路。

16、采用本发明所提供的方法对样品材料进行鉴定，推测柑橘潜叶蛾的被寄生率，与传统肉眼观察方法相比灵敏度较高，技术耗时更短。经实施例验证，本发明设计出的引物能特异地扩增出白星姬小蜂365bp的线粒体基因片段，而仅以柑橘潜叶蛾的dna为模板扩增时无任何条带，田间随机采集的样品能检测出白星姬小蜂。

技术特征：

1.一种白星姬小蜂线粒体cytb基因，其特征在于，所述线粒体cytb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种扩增权利要求1所述线粒体cytb基因的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列序列，所述下游引物包括如seq id no.3所示的核苷酸序列。

3.一种扩增权利要求1所述线粒体cytb基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物对。

4.权利要求1所述线粒体cytb基因或权利要求2所述引物对或权利要求3所述的试剂盒在检测和/或鉴定白星姬小蜂中的应用。

5.一种检测白星姬小蜂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括柑橘潜叶蛾和/或含有柑橘潜叶蛾的叶片。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩增的体系为：10μmol/l上游引物1μl、10μmol/l下游引物1μl、2×pcr supermix 10μl、模板dna2μl，ddh2o 6μl。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

9.权利要求1所述cytb基因或权利要求2所述引物对或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4～8任一项所述方法在辅助防治柑橘潜叶蛾中的应用。

10.权利要求1所述cytb基因或权利要求2所述引物对或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4～8任一项所述方法在检测白星姬小蜂寄生率中的应用。

技术总结
本发明属于昆虫分类和分子生物学技术领域，具体涉及一种白星姬小蜂线粒体CYTB基因及其应用和鉴定白星姬小蜂的方法。本发明提供的白星姬小蜂线粒体CYTB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因特异地存在于白星姬小蜂线粒体中，与柑橘潜叶蛾的线粒体基因具有明显差异，且易于扩增，因此能够用于白星姬小蜂的分子生物学鉴定，为白星姬小蜂的鉴定提供了新的方法和思路。

技术研发人员：杜一民,潘静,谭名山,陈晗馨,潘祥凤,韩丽娟,卢占军
受保护的技术使用者：赣南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/10/17