一种甘松倍半萜类合成酶基因NjTPS48及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种甘松倍半萜类合成酶基因njtps48及其应用。

背景技术：

1、甘松nardostachys jatamansi(d.on)dc.为极度濒危的药用植物，主要分布于海拔2300～5000m的喜马拉雅山脉高山地区，具有理气止痛、开郁醒脾、外用祛湿消肿等功效，被广泛用于药物、化妆品制备等。生物合成途径的解析对揭示生命活动、分子辅助育种、异源生物合成重要次生代谢产物等有重要意义。目前，甘松主要集中于化学成分和药理作用研究，鲜有对次生代谢产物合成机制的研究报道。

2、甘松精油是国际各大品牌香水必须的定香剂，具有重要价值。化学分析表明甘松精油中富含maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物。上述成分由于难以通过化学合成，主要从自然界中提取分离，但它们在自然界中含量较低，获取存在较大挑战。利用现代生物技术，通过酶催化定向绿色合成是潜在的有效策略。作为倍半萜烷烃类化合物，由倍半萜类合成酶(terpene synthases，tps)催化法尼基焦磷酸fpp底物是合成倍半萜烷烃类化合物的关键步骤。经检索，目前从动植物、微生物中报道了一些能合成倍半萜类烷烃类化合物的tps酶，但能催化产上述化合物的tps酶尚未见报道，特别是能同时产上述化合物的。从甘松中鉴别出能催化fpp产maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物生物合成的tps关键酶，对于异源绿色合成上述化合物具有重要意义，具有重要的商业化或工业化应用价值。

3、结合上述，目前，maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物主要通过从植物中分离提取获得，但在植物中含量较低，且植物成分复杂，难以分离提取到上述化合物。对于它们的生物合成研究，产前提化合物fpp的上游合成步骤中的相关基因已得到解析。但能催化fpp同时产maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物生物合成的tps关键酶尚未解析。

4、因此，我们提供一种甘松倍半萜类合成酶基因njtps48及其应用，鉴定能同时催化fpp产maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物生物合成的tps关键酶，为这些化合物的绿色异源合成提供参考。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种甘松倍半萜类合成酶基因njtps48及其应用，用于鉴定能同时催化fpp产maaliol、globulol、spathulenol等倍半萜化合物生物合成的tps关键酶，为这些化合物的绿色异源合成提供参考。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、njtps48基因在倍半萜化合物制备上的应用，所述njtps48基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

4、进一步的，所述倍半萜化合物至少包括以下种的至少一种：maaliol、globulol、spathulenol。

5、njtps48基因表达的.njtps48蛋白在倍半萜化合物制备上的应用，所述ms87蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

6、进一步的，所述倍半萜化合物至少包括以下种的至少一种：maaliol、globulol、spathulenol。

7、利用njtps48基因制备倍半萜化合物的方法，包括以下步骤：

8、第一步、克隆njtps48基因

9、从研磨好的甘松根茎中提取出rna，并将rna反转录为cdna；

10、以cdna为模板，结合上游引物和下游引物使用超保真酶扩增出njtps48基因；

11、第二步、构建pet-28a(+)/njtps48重组载体

12、在所述上游引物中加上bamh i酶切位点处同源臂，在所述下游引物中加上hindⅲ酶切位点处同源臂；

13、以回收产物为模板，使用含同源臂的引物进行二次扩增，并对njtps48条带进行切胶回收；

14、使用bamh i和hindⅲ内切酶对pet-28a(+)载体进行双酶切，酶切产物经胶回收，得到线性化的pet-28a(+)载体；

15、将带同源臂的njtps48基因与线性化的pet-28a(+)载体进行同源重组，重组产物按照热激法转化到大肠杆菌dh5α中，构建出pet28a(+)/njtps48重组质粒；

16、第三步、转产fpp的底盘大肠杆菌及发酵

17、将融合了大肠杆菌的atob、idi、ispa基因，以及酿酒酵母的hmg-coa、mvd1、erg8、erg12和经n端修饰的thmgr基因的产fpp的重组质粒pmevt-mbis，与pet28a(+)/njtps48重组质粒一起同时转化大肠杆菌c41感受态细胞；

18、将所述大肠杆菌c41感受态细胞转入到发酵菌液中，发酵得到倍半萜产物。

19、进一步的，所述上游引物为：atggacagctaccttaatgc；所述下游引物为：ttaaatacatacctcatgtccaacc。

20、进一步的，所述bamh i酶切位点处同源臂为：cagcaaatgggtcgcggatcc；所述hindⅲ酶切位点处同源臂为：ctcgagtgcggccgcaagctt。

21、进一步的，所述发酵得到倍半萜产物包括maaliol、globulol和spathulenol。

22、本发明至少具备以下有益效果：

23、本发明首次表征了甘松njtps48基因在参与maaliol、globulol、spathulenol生物合成途径中的独特作用。采用pcr技术成功从甘松中克隆得到njtps48基因的cdna序列，接着通过同源重组的方法将片段构建到pet28a(+)原核表达载体上，将重组的pet28a(+)/njtps48转化到产fpp的大肠杆菌底盘菌株，诱导菌株中njtps48蛋白表达，最终首次实现了在大肠杆菌中同时产maaliol、globulol和spathulenol。

技术特征：

1.njtps48基因在倍半萜化合物制备上的应用，其特征在于，所述njtps48基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述倍半萜化合物至少包括以下种的至少一种：maaliol、globulol、spathulenol。

3.njtps48基因表达的.njtps48蛋白在倍半萜化合物制备上的应用，其特征在于，所述ms87蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述倍半萜化合物至少包括以下种的至少一种：maaliol、globulol、spathulenol。

5.利用njtps48基因制备倍半萜化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游引物为：atggacagctaccttaatgc；所述下游引物为：ttaaatacatacctcatgtccaacc。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述bamh i酶切位点处同源臂为：cagcaaatgggtcgcggatcc；所述hindⅲ酶切位点处同源臂为：ctcgagtgcggccgcaagctt。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵得到倍半萜产物包括maaliol、globulol和spathulenol。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种甘松倍半萜类合成酶基因NjTPS48及其应用。NjTPS48基因应用在倍半萜化合物制备上，所述NjTPS48基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或者具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列，所述倍半萜化合物至少包括以下种的至少一种：Maaliol、Globulol、Spathulenol。本发明首次表征了甘松NjTPS48基因在参与Maaliol、Globulol、Spathulenol生物合成途径中的独特作用。采用PCR技术成功从甘松中克隆得到NjTPS48基因的cDNA序列，接着通过同源重组的方法将片段构建到pET28a(+)原核表达载体上，将重组的pET28a(+)/NjTPS48转化到产FPP的大肠杆菌底盘菌株，诱导菌株中NjTPS48蛋白表达，最终首次实现了在大肠杆菌中同时产Maaliol、Globulol和Spathulenol。

技术研发人员：青贤,刘十祎,苏琪,王惠仪
受保护的技术使用者：四川香原珍稀中药科技开发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10